川芎嗪減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的作用機(jī)制研究

鄭小芳 胡慧佳 李躍 周燕 王利民

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明的以尋常性間質(zhì)性肺炎為特征性病理改變的慢性間質(zhì)性肺疾病，該病治療手段有限且療效欠佳，確診后中位生存期僅2～4年。近年研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮和尼達(dá)尼布等抗纖維化藥物在改善IPF患者癥狀及延緩肺功能下降方面有一定效果，但該類藥物價(jià)格昂貴且安全性尚未完全確認(rèn)[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“瘀血內(nèi)阻”貫穿該病始終，川芎為行氣活血的代表中藥，臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)以川芎為主的中藥制劑及其主要成分川芎嗪能改善百草枯、博萊霉素（bleomycin，BLM）、矽肺等因素所致的肺纖維化。其中BLM氣道內(nèi)滴注所致的肺纖維化模型，其病理生理與人類肺間質(zhì)纖維化相似，因此廣泛應(yīng)用于IPF的研究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是纖維化疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，而Sonic Hedgehog（Shh）蛋白在肺損傷時(shí)過(guò)度激活，參與肺泡上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)過(guò)程，最終引起肺組織重塑[2]。Coon等[3]研究表明Shh信號(hào)通路活性與組織纖維化程度呈正相關(guān)。本研究旨在探討川芎嗪減輕BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的作用機(jī)制，以及該作用機(jī)制是否通過(guò)Shh信號(hào)通路抑制EMT過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠60只，體重（230±20）g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境中，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度60%～70%，每日光照明、暗各12h，以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，所有操作均通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要材料及儀器 硫酸BLM（批號(hào)：H1608020，規(guī)格：20g，杭州瑞宏生物技術(shù)有限公司）；川芎嗪（批號(hào)：FY17630226，純度98%，南通經(jīng)緯生物科技有限公司）；環(huán)巴胺（Cyc，批號(hào)：HBA20170706B，純度＞98%，南京特拉維斯生物科技有限公司）；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20171218，規(guī)格：50管/48樣，南京建成科技有限公司）；兔緊密連接蛋白-1（ZO-1）多克隆抗體（批號(hào)：057102，規(guī)格：100μl，美國(guó) Proteintech 公司）；兔 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號(hào)：81A40002015，規(guī)格：100μl，英國(guó)Abcam公司）；兔Shh多克隆抗體（批號(hào)：81A8420014，規(guī)格：100μl，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；兔膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物-1（Gli1）多克隆抗體（批號(hào)：GR3202163-7，規(guī)格：100μl，英國(guó) Abcam公司）；病理圖文分析系統(tǒng)（德國(guó)卡爾蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為對(duì)照組（Con組）、模型組（BLM組）、川芎嗪低劑量組（L-Lig組）、川芎嗪中劑量組（M-Lig組）、川芎嗪高劑量組（H-Lig組）和Shh通路抑制陽(yáng)性對(duì)照Cyc組（Cyc組）6組，每組10只。除對(duì)照組外，其余5組采用一次性氣道滴注BLM溶液（藥物溶于0.9%氯化鈉溶液，4mg/ml）1.25ml/kg構(gòu)建肺纖維化模型。于造模次日起，Con組和BLM組每日予0.9%氯化鈉溶液2.5ml/kg灌胃給藥，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組每日分別予川芎嗪溶液（藥物溶于0.9%氯化鈉溶液，8mg/ml）1.25、2.5和5.0ml/kg灌胃給藥，Cyc組每日予Cyc（藥物溶于10%DMSO溶液，2mg/ml）5.0ml/kg腹腔注射給藥，各組均給藥56d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Con組無(wú)動(dòng)物脫組，BLM組脫組5只，L-Lig組、M-Lig組和 H-Lig組分別脫組 1、3、3 只，Cyc組脫組4只，最終Con組10只，BLM組5只，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組分別為9、7、7只，Cyc組6只。1.3.2 標(biāo)本收集 造模后第56天處死大鼠并收集標(biāo)本。1.3.2.1 血清 3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用剪刀先剪去劍突處鼠毛，75%乙醇溶液消毒皮膚，持5ml注射器針頭緊貼劍突下以30°斜行向上進(jìn)針刺入心臟采血5～6ml，3 000r/min，離心10min后取血清保存至-20℃冰箱內(nèi)。

1.3.2.2 肺組織 打開(kāi)胸腔，分離肺組織（注意清理肺門(mén)周?chē)浗M織），切取左肺組織保存于-80℃冰箱，以備Western blot檢測(cè)；切取右肺組織在0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，置于4%甲醛中固定，用于后續(xù)HE染色及Masson三色染色。

1.3.3 肺組織病理形態(tài)觀察及Ashcroft評(píng)分 右肺組織經(jīng)甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋切片、脫蠟、HE染色、脫水封片后，光學(xué)顯微鏡100倍視野下觀察肺組織病理形態(tài)。根據(jù)Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)肺泡炎和肺纖維化程度評(píng)分，0分：肺組織結(jié)構(gòu)正常；1分：肺泡間隔或支氣管壁輕度增厚；3分：肺泡間隔或支氣管壁中度增厚，但不伴有明顯的肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；5分：肺泡結(jié)構(gòu)破壞，有條索狀纖維帶或纖維組織團(tuán)塊形成；7分：肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，廣泛的纖維灶形成，蜂窩肺；8分：滿視野纖維化病灶；2、4、6分介于相應(yīng)分?jǐn)?shù)之間。

1.3.4 肺組織膠原沉積面積計(jì)算 右肺組織固定至切片，脫蠟步驟同上，經(jīng)鐵蘇木素、麗春紅、苯胺藍(lán)染液完成Masson三色染色，使用病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算藍(lán)染的膠原沉積面積。

1.3.5 血清羥脯氨酸含量檢測(cè) 采用堿水解法。血清樣本經(jīng)水解、調(diào)pH至6.0～6.8、加入活性炭后離心取上清液，檢測(cè)波長(zhǎng)550nm處吸光度值，羥脯氨酸含量（μg/ml）=[（測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）] ×標(biāo)準(zhǔn)管含量（5mg/ml）×[（水解液總體積（10ml）/取樣量（ml）] 。

1.3.6 肺組織EMT相關(guān)指標(biāo)ZO-1、α-SMA、Shh信號(hào)通路Shh蛋白及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用Western blot法。取部分肺組織加入組織裂解液（每10mg肺組織加入200μl裂解液），于4℃勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，14 000r/min，離心5min后取上清液，加5×上樣緩沖液后煮沸5min。制備10%SDS-PAGE膠，按40μg蛋白量上樣；80V電泳至Marker分離后改120V；300mA轉(zhuǎn)膜100min；5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入ZO-1（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）、Shh（1∶1 000）、Gli1（1∶2 000）一抗后4℃過(guò)夜；TBST洗滌3遍后加入二抗，室溫?fù)u床孵育2h；TBST洗膜后ECL顯像，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)及Ashcroft評(píng)分比較HE染色結(jié)果顯示Con組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔正常，無(wú)明顯水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn)，肺泡腔內(nèi)無(wú)明顯滲出（圖1a，見(jiàn)插頁(yè)）；BLM組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔萎縮或消失，部分肺泡出現(xiàn)斷裂、融合，形成肺大泡，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)被纖維細(xì)胞替代，肺間質(zhì)纖維化形成，部分有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1b，見(jiàn)插頁(yè)）；L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和 Cyc組肺泡破壞，間隔增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較BLM組輕，肺間質(zhì)被纖維細(xì)胞替代，呈不同程度肺間質(zhì)纖維化，但程度較BLM組減輕（圖1c-f，見(jiàn)插頁(yè)）。肺組織Ashcroft評(píng)分結(jié)果顯示，與Con組比較，BLM組Ashcroft評(píng)分增加（P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組Ashcroft評(píng)分較均下降（均P＜0.05），但各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 1。2.2 各組大鼠肺組織膠原沉積面積比較 Masson三色染色結(jié)果顯示Con組肺泡結(jié)構(gòu)正常，被藍(lán)染區(qū)域極少（圖2a，見(jiàn)插頁(yè)）；BLM組肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡融合，肺間質(zhì)、支氣管壁和肺泡隔被藍(lán)染區(qū)域面積明顯增加，間質(zhì)膠原增生沉積呈彌漫性，呈片狀、束狀（圖2b，見(jiàn)插頁(yè)）；而L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組肺泡結(jié)構(gòu)破壞及藍(lán)染區(qū)域較BLM組明顯減少（圖2c-f，見(jiàn)插頁(yè)）。與Con組比較，BLM組膠原沉積面積增加（P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和Cyc組膠原沉積面積均減少（均P＜0.05），但各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表1 各組大鼠肺組織Ashcroft評(píng)分比較（分）

表2 各組大鼠肺組織膠原沉積面積比較（%）

2.3 各組大鼠血清羥脯氨酸含量比較 與Con組比較，BLM組血清羥脯氨酸含量增加（P＜0.05）；川芎嗪干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組血清羥脯氨酸含量均下降（均P＜0.05），但各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；Cyc干預(yù)后，Cyc組與BLM組血清羥脯氨酸含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠血清羥脯氨酸含量比較（μg/ml）

2.4 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較 與Con組比較，BLM組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。川芎嗪或Cyc干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig和Cyc組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)圖3和表4。

圖3 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組大鼠肺組織ZO-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平比較 與Con組比較，BLM組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05）；川芎嗪或Cyc干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組、H-Lig組和 Cyc組大鼠 Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)圖4和表5。

圖4 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組大鼠肺組織Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

川芎嗪是中藥川芎的主要活性成分，大量研究證實(shí)川芎嗪可減輕BLM誘導(dǎo)的肺泡炎癥與肺間質(zhì)纖維化[5-6]。本研究使用BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型，探討川芎嗪的抗肺纖維化作用及其可能機(jī)制。

肺組織病理的改變是最直觀的療效衡量標(biāo)準(zhǔn)。本研究病理評(píng)分顯示，大鼠肺纖維化模型肺泡炎與肺纖維評(píng)分較Con組升高，表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱鞒晒?。?jīng)川芎嗪干預(yù)后，大鼠肺組織Ashcroft評(píng)分下降，血清羥脯氨酸含量下降。由于羥脯氨酸是膠原的主要成分之一，其水平間接反映組織中膠原含量，提示川芎嗪能抑制BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積，降低肺組織羥脯氨酸含量及膠原沉積面積，減輕肺纖維化程度。

目前IPF的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，普遍認(rèn)為與上皮損傷、炎癥、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，使得肺組織損傷與修復(fù)失衡，肌成纖維細(xì)胞增多，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，肺組織重塑[7-8]。EMT被認(rèn)為是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，包括發(fā)育障礙、器官纖維化、腫瘤等[9]。炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等可以激活EMT，導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志分子如ZO-1表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子如α-SMA等表達(dá)上調(diào)，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化成紡錘形的間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)肺纖維化發(fā)生、發(fā)展[10-11]。本研究中，筆者檢測(cè)了EMT相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示BLM組肺組織ZO-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，α-SMA蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而川芎嗪干預(yù)后，與BLM組比較，L-Lig組、M-Lig組和H-Lig組大鼠肺組織ZO-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，且α-SMA蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示川芎嗪通過(guò)抑制EMT，減輕肺纖維化程度。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，IPF的發(fā)生與調(diào)控發(fā)育的信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[12]，Shh信號(hào)通路正?；罨欠伟l(fā)育的必要條件，它控制了早期肺部發(fā)育和適當(dāng)?shù)姆畏种螒B(tài)形成時(shí)的EMT[13]。在其他器官中，Shh信號(hào)通路已被證實(shí)會(huì)促進(jìn)纖維化。例如，在斑馬魚(yú)胰腺癌中，旁分泌的Shh信號(hào)會(huì)導(dǎo)致纖維化反應(yīng)[14]、Shh通路過(guò)度激活也會(huì)促進(jìn)腎纖維化[15-16]、肝纖維化[17]和硬皮病的皮膚纖維[18-19]。在成纖維細(xì)胞中激活Shh信號(hào)通路也可能是重要的發(fā)病機(jī)制，該基因信號(hào)會(huì)刺激成纖維細(xì)胞釋放膠原蛋白以及向肌纖維細(xì)胞分化[20]。研究證明，Shh信號(hào)通路參與基底增生、細(xì)胞外基質(zhì)合成和α-SMA的表達(dá)過(guò)程[21-22]。已有研究通過(guò)瞄準(zhǔn)Gli轉(zhuǎn)錄因子抑制Shh基因信號(hào)，在小鼠模型中預(yù)防肺纖維化取得理想結(jié)果[23]。本研究中，筆者檢測(cè)了Shh蛋白及其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白表達(dá)水平，并以Shh信號(hào)通路抑制劑Cyc為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，BLM組Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平均高于Con組，川芎嗪能夠抑制Shh信號(hào)通路，減少Shh、Gli1的表達(dá)。同時(shí)結(jié)果顯示，Cyc能抑制BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積，并能抑制BLM誘導(dǎo)的ZO-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)及α-SMA蛋白表達(dá)水平上調(diào)。提示Shh信號(hào)通路參與了BLM誘導(dǎo)的肺纖維化過(guò)程，同時(shí)抑制Shh信號(hào)通路是川芎嗪改善BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的機(jī)制之一。

綜上所述，Shh信號(hào)通路參與了肺纖維化的形成，川芎嗪通過(guò)抑制Shh信號(hào)通路，從而抑制EMT，減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型的肺泡炎癥及肺纖維化程度，為川芎嗪治療IPF提供了理論依據(jù)。