虎杖苷轉(zhuǎn)化菌的篩選及所產(chǎn)酶的性質(zhì)研究

張玉千 周學(xué) 鄭丹

摘要：利用專一性底物法，以虎杖水提液為初始培養(yǎng)基，經(jīng)過初篩復(fù)篩獲得轉(zhuǎn)化菌。根據(jù)菌落形態(tài)特征對菌株進(jìn)行初步鑒定，對轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，通過篩選得到1株特異性轉(zhuǎn)化虎杖苷為白藜蘆醇的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為青霉菌。該菌產(chǎn)的酶最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃;Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有激活作用;虎杖苷是該酶理想的水解作用底物。利用該菌產(chǎn)的酶液轉(zhuǎn)化虎杖原料，虎杖苷的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到100%。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇;青霉菌;微生物轉(zhuǎn)化;虎杖苷

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0264-04

虎杖是一種常用的中藥原料，主要活性成分是虎杖苷（白藜蘆醇苷）、白藜蘆醇和蒽醌類化合物。其中，白藜蘆醇活性較高，具有抗炎殺菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、保護(hù)心血管及免疫調(diào)節(jié)等活性[1-8]。白藜蘆醇的制備方法有傳統(tǒng)提取法、微生物轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法。傳統(tǒng)提取法主要以蓼科、葡萄科、豆科植物為原料提取[9-10]。其中，蓼科植物虎杖中白藜蘆醇的含量可達(dá)0.45%，虎杖苷的含量最高可達(dá)2.55%[11]?；⒄溶帐前邹继J醇與β-D-葡萄糖結(jié)合形成的糖苷，水解該糖苷鍵可以將虎杖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇[12]。如果能將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，理論上可使其含量提高3.3倍[13]，可以大大增加虎杖的藥用價值。

針對虎杖苷中β-D-葡萄糖苷鍵的水解方法有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)降解法工序復(fù)雜，成本高，分離純化困難，且白藜蘆醇光熱穩(wěn)定性差[14]，所以對虎杖苷的化學(xué)降解方法研究得較少。生物轉(zhuǎn)化法中，王輝以篩選出高活性β-葡萄糖苷酶為依據(jù)篩選出米曲霉，利用該菌搖瓶發(fā)酵46 h后，虎杖苷可以被完全轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇[15]。田天麗篩選得到根霉 T-34，通過帶渣固體發(fā)酵技術(shù)在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵24 h后虎杖苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%[13]。馮薇等篩選出細(xì)菌轉(zhuǎn)化虎杖苷，8 h轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上。微生物轉(zhuǎn)化虎杖的本質(zhì)是通過所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷，利用商品酶或利用微生物制備的酶制劑可用于虎杖苷的轉(zhuǎn)化。王輝利用米曲霉所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶粗酶液直接處理虎杖粗藥材，12 h轉(zhuǎn)化率達(dá)100%[15]。

陳蓉蓉等對多種商品酶進(jìn)行了篩選，確定以β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化效果最好，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%[16]。生物酶的轉(zhuǎn)化工藝較穩(wěn)定，做成固定化酶可重復(fù)利用，轉(zhuǎn)化效率高，但酶的純化較為困難，商品酶成本高，在工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。利用微生物產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化虎杖苷較為可行，而篩選出轉(zhuǎn)化時間短、轉(zhuǎn)化效率高的菌種尤為重要。本試驗(yàn)篩選得到1株轉(zhuǎn)化菌，對轉(zhuǎn)化菌所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并且用粗酶液直接轉(zhuǎn)化虎杖原料粉末。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：青霉菌。

初篩培養(yǎng)基（%）：10%虎杖煮提液，MgSO4 0.05 g，NaNO3 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.001 g，KH2PO4 0.1 g，瓊脂1.8 g，pH值自然。

復(fù)篩培養(yǎng)基：10%虎杖煮提液，pH值自然。

固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮、豆粕粉（碳氮比為6 ∶ 4）。

固體營養(yǎng)液：磷酸氫二鈉1 g，硫酸銨2 g，硫酸鎂0.1 g，加水定容至100 mL，固液比為1 ∶ 2。

材料：虎杖藥材產(chǎn)自江蘇省寶華山。白藜蘆醇苷、白藜蘆醇對照品的純度為98%，購自西安華翠生物技術(shù)有限公司。甲醇（HPLC級）、乙醇、乙睛（HPLC級）、乙酸乙酯。

儀器：GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）;ES-315高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，Japan）;Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent公司）;HD-930型組合式全溫?fù)u床（江蘇太倉市博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠）;高速離心機(jī)Sigma 3k30（Sigma公司）。

1.2 菌種篩選與鑒定

1.2.1 虎杖苷轉(zhuǎn)化菌的篩選 初篩：取虎杖粉末用無菌水沖洗，梯度稀釋，按常規(guī)方法涂布，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑選出長勢良好的單菌落，保藏待用。復(fù)篩：將初篩菌種活化培養(yǎng)，制成孢子懸液，轉(zhuǎn)接至復(fù)篩培養(yǎng)基，30 ℃、160 rpm培養(yǎng)，取樣檢測。

1.2.2 菌種鑒定 將篩選到的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同時間觀察菌落生長性狀，待產(chǎn)孢后取菌絲制作臨時玻片在透視顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子，并描述它們的形態(tài)特征;用透視顯微鏡觀察菌絲的自然生長和分支狀況。根據(jù)形態(tài)特征對菌株進(jìn)行分類鑒定。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 粗酶液的制備 將活化后的菌種斜面用無菌水制成孢子懸浮液，接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，28 ℃條件下靜止培養(yǎng)48 h。取固體曲，用pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸提，固液比為1 ∶ 10，將其用尼龍紗布過濾，4 500 rpm離心15 min，上清液即為酶液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶最適溫度及穩(wěn)定性 在不同溫度下分別以1%水楊苷和0.05%虎杖苷為底物，按常規(guī)法測定酶活力，分別于50、55、60、65、70 ℃測定酶活力。酶液分別在30、40、50、60、70 ℃下保溫12 h，測定酶活力。取酶液，放于 60 ℃ 水浴中，分別在2、4、6、8、10、12 h取樣，檢測酶活力。

1.3.3 pH值對β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸堿穩(wěn)定性的影響 分別配制pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液，常規(guī)方法測定酶活力。此外，將酶液與上述不同pH值緩沖液在60 ℃下放置1 h后，按常規(guī)法測定對應(yīng)的酶活力。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特異性 分別配制濃度為 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水楊苷、纖維二糖、京尼平苷溶液，再以它們?yōu)榈孜?，按常?guī)法測定對應(yīng)的酶活力。

1.3.5 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響 選取氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈷為試劑，在酶反應(yīng)液中分別加入上述金屬離子，使其終濃度為1.0 mmol/L，于60 ℃溫30 min，按常規(guī)法測定酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法

水楊苷法測定β-葡萄糖苷酶活力：于0.2 mL水楊苷溶液中加入0.2 mL酶液，混勻后60 ℃反應(yīng)10 min，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑后沸水浴5 min，冷卻后蒸餾水定容至10 mL，在540 nm下測定其吸光度。

酶活力單位定義：1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反應(yīng)1 min，產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖苷轉(zhuǎn)化菌的篩選

通過初篩得到11株長勢較好的菌種，菌株編號及轉(zhuǎn)化27 h虎杖苷轉(zhuǎn)化率如圖1所示。初篩獲得的11株菌種中，僅有H4、H6和2-6號菌有轉(zhuǎn)化效果，且在轉(zhuǎn)化27 h后轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了最大。其中H6號菌的轉(zhuǎn)化率最高，為98%，故選取H6號菌作為虎杖苷轉(zhuǎn)化菌株。

2.2 轉(zhuǎn)化菌的鑒定

通過觀察，菌落為綠色，背面為黃色。顯微鏡下觀察并記錄菌種的顯微形態(tài)。由圖2可知，顯微鏡下菌絲無色透明，表面光滑，有隔膜，直徑為4～5 μm，菌絲上產(chǎn)生簡單的長而直立的分生孢子梗，分生孢子梗分枝呈掃帚狀。孢子梗上著生分生孢子鏈，分生孢子為橢圓形，兩端稍細(xì)，長5～7 μm，寬 3～4 μm。根據(jù)以上菌落形態(tài)、菌絲形狀、孢子的形狀及大小，初步確定為青霉屬。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 β-葡萄糖苷酶最適溫度 由圖3-a和圖3-b可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，酶活力先提高后降低，在60 ℃時酶活力最高。以水楊苷為底物和以虎杖苷為底物測得的酶活力變化趨勢一致。以水楊苷為底物測定酶活力能準(zhǔn)確地反映該酶對底物的轉(zhuǎn)化能力。

2.3.2 酶的穩(wěn)定性影響 酶液分別在30、40、50、60、70 ℃下保溫12 h，按常規(guī)法測定對應(yīng)的酶活力。取酶液，放于60 ℃水浴中保藏，分別在2、4、6、8、10、12 h取樣，常規(guī)方法檢測酶活力。由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保溫12 h后基本不失活，在60 ℃保溫12 h后酶活力有損失，60 ℃以后酶活力損失較大。由圖5可知，60 ℃下，1～10 h內(nèi)酶活力較穩(wěn)定，10 h后酶活力降幅較大。

2.3.3 pH值對β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸堿穩(wěn)定性的影響 分別配制pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液，采用常規(guī)方法測定酶活力。此外，將酶液與上述不同pH值緩沖液在60 ℃下放置1 h后，按常規(guī)法測定其對應(yīng)的酶活力。由圖6可知，β-葡萄糖苷酶活力隨著pH值的上升先提高后降低，在pH值為5.0時酶活力最高，這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的一致。由圖7可知，酶在pH值為4.0～6.0之間時，相對酶活力較高，保持了較高的穩(wěn)定性，在pH值>6.0或pH值<4.0時，酶活力明顯下降。

2.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特異性 在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用 0.5% 的不同底物與酶液反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，酶對虎杖苷的水解效果最好，對水楊苷的水解效果其次，對纖維二糖和京尼平苷的水解效果較差，對甜菊苷的水解效果最弱。

2.3.5 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響 選取氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈷為試劑。在酶反應(yīng)液中分別加入上述金屬離子， 使其終濃度為 1.0 mmol/L， 于60 ℃溫30 min，按常規(guī)法測定對應(yīng)的酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%。從表2可以看出，金屬陽離子對該酶都有不同程度的影響，其中Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有輕微的激活作用，而Mg2+和Co2+則有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過初篩和復(fù)篩得到1株霉菌，可將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為青霉菌屬。對其所產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：酶的最適pH值為5.0，pH值在4.0～6.0之間時，酶的穩(wěn)定性較好;酶最適反應(yīng)溫度為 60 ℃，并且在該溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性;Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有激活作用;虎杖苷是該酶理想的水解作用底物。

本試驗(yàn)的結(jié)果可以拓展白藜蘆醇的制備途徑[17]，增加虎杖的利用價值。可以用虎杖中藥材為原料，先提取虎杖苷，利用該菌株所產(chǎn)的酶液轉(zhuǎn)化虎杖苷，或?qū)⒚敢褐瞥晒潭ɑ冈賹⒒⒄溶辙D(zhuǎn)化成白藜蘆醇。另外，還可以將虎杖藥材粉碎后與該菌進(jìn)行共發(fā)酵，從發(fā)酵后的固體曲中提取白藜蘆醇。

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