玉米芯木聚糖硫酸酯的合成、表征及其抗凝血活性

樊洪玉, 衛(wèi) 民,2*, 趙 劍, 蔣劍春

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042； 2.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)新技術研究所， 北京 100091)

半纖維素是重要的天然多糖，由于其具有良好的生物相容性、生物降解性和無毒性等特性，已廣泛應用于食品和非食品領域。玉米芯中的半纖維素含量較高，半纖維素的結(jié)構(gòu)為聚木糖型。大多數(shù)的研究通常使用玉米芯為原料，采用生物化學法來提取木聚糖，但所得的木聚糖相對分子質(zhì)量較小、聚合度在2～3之間，為低聚木糖，主要作為功能性保健品[1-3]。近年來，利用玉米芯半纖維素木聚糖的生物特性來研發(fā)高附加值的化學品和醫(yī)藥產(chǎn)品得到了廣泛的關注[4-6]。臨床上常使用的抗凝血劑和抗血栓劑為肝素鈉，但是在使用的過程中通常存在出血和血小板減少癥的副作用[7]。有研究表明，硫酸根離子與多糖結(jié)合而成的硫酸化多糖具有優(yōu)異的血液相容性和抗凝血活性。因此，具有無健康風險的新的抗凝血和抗血栓特性的硫酸化多糖成為新的研究熱點[8-10]。Liang等[11]使用南瓜多糖為原料合成了硫酸化衍生物，該衍生物在較高的取代度(DS)時，可以獲得較強的抗凝活性。Kamitakahara等[12]合成的新型硫酸化多糖不僅具有抗凝血活性，還對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移有抑制作用。天然木聚糖通常是具有不同結(jié)構(gòu)和生理活性的大分子的混合物，將硫酸基團引入天然多糖是獲得具有生物學性質(zhì)的抗凝血劑的有效方式。但是多糖在提取制備過程中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并且在硫酸化改性的過程中，尤其是在強酸性條件下容易降解，反應條件難于控制，制備的硫酸化多糖相對分子質(zhì)量分散系數(shù)大，分布較寬，是一個混合體，其抗凝機理和潛在功效仍在不斷探索中。因此需尋找一種適用于所用多糖原料的反應條件溫和可控，且產(chǎn)物性能穩(wěn)定的硫酸酯化改性方法。由于木聚糖不溶于水及大部分溶劑，而在加熱的條件下可溶于非質(zhì)子溶劑DMF、DMSO、FA等。因此，本研究以玉米芯木聚糖為原料，在不同的非質(zhì)子溶劑中，通過三氧化硫-吡啶法合成了木聚糖硫酸酯，采用正交試驗對合成工藝進行了優(yōu)化，并對其結(jié)構(gòu)和性能進行了表征，進一步測定了其體外抗凝血活性，以期為木聚糖硫酸酯作為新型抗凝血劑的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

玉米芯取自山東省聊城市，經(jīng)自然風干后，選擇無霉變、無蟲蛀的玉米芯，破碎，過0.25 mm孔徑篩。將得到的玉米芯粉末用質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇溶液在索氏提取器中抽提12 h，脫除蠟質(zhì)。用去離子水洗滌，真空干燥，置于干燥器中備用。原料的主要化學組成可參照美國國家可再生能源實驗室標準(NREL/TP-510- 42618)測定，測得所用原料含纖維素39.03%、半纖維素33.18%、木質(zhì)素14.23%。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、甲酰胺(FA)均為分析純，并在使用前用5?分子篩處理除去水?；罨糠帜蠲笗r間(APTT)、凝血酶原時間(PT)和凝血酶時間(TT)試劑盒，上海太陽生物技術有限公司。肝素鈉(MW為6 000～20 000 u)，上海博奧生物技術有限公司。三氧化硫吡啶絡合物，國藥集團化學試劑有限公司。新鮮血液從江蘇省血液中心收集。其他試劑均為市售分析純。

CN61M308113凝膠色譜儀，北京中西化玻儀器有限公司；Thermo Fisher Nicolet IS 10型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，美國Thermo公司；Elemental Vario MICRO元素分析儀，德國Elementar公司；Bruker WNMR-I-500 MHz型核磁共振波譜儀，德國Bruker公司。

1.2 玉米芯木聚糖的分離制備

取脫蠟后的玉米芯20 g，按照固液比1 ∶25(g ∶mL，下同)加入去離子水，75 ℃抽提3 h。固液分離，向濾渣中按照固液比1 ∶20加入堿性過氧化氫溶液(1% H2O2、 5% NaOH)，50 ℃處理16 h。減壓過濾，用鹽酸中和至中性，減壓濃縮至250 mL，向所得的液體中加入1 L的質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇，離心分離(8 000 r/min，15 min)，洗滌固體沉淀、去離子水透析、冷凍干燥后得到木聚糖產(chǎn)品，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

提純后的玉米芯木聚糖主要化學組成參照NREL/TP-510- 42618測定，其中木聚糖73.5%、阿拉伯聚糖14.7%、半乳聚糖5.9%和葡聚糖5.8%(以干質(zhì)量計)。

1.3 木聚糖硫酸酯的合成

玉米芯木聚糖是由D-吡喃型木糖單元通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的，在一定條件下D-木糖單元C-2和C-3鍵上的羥基可以與三氧化硫吡啶絡合物(SO3·Py)發(fā)生酯化反應，合成玉米芯木聚糖硫酸酯，反應原理如圖1所示[13]。將2 g LiCl固體加入到20 mL的非質(zhì)子溶劑(DMF、DMSO或FA)中，加熱攪拌至LiCl固體完全溶解。冷卻至室溫后，再加入1.8 g木聚糖，加熱溶解。冷卻至室溫，加入三氧化硫吡啶絡合物，在給定的溫度和時間下反應。反應結(jié)束后，冰浴冷卻至室溫，用質(zhì)量分數(shù)5%NaOH溶液中和，加入一定量的無水乙醇，靜置。離心分離，得到木聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品。然后，將木聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品在截留相對分子質(zhì)量為3 500的透析袋中用去離子水透析4天(每隔8 h更換一次水)，除去無機鹽和一些小分子的降解產(chǎn)物。最后將溶液冷凍干燥，得到木聚糖硫酸酯產(chǎn)品。

圖1 木聚糖硫酸酯的合成過程Fig.1 The schematic diagram for the synthesis of xylan sulfate

1.4 分析與表征

1.4.1 硫酸基取代度的測定 采用氯化鋇-明膠法測定硫酸基的質(zhì)量分數(shù)[14-15]。取代度(DS)可根據(jù)硫元素質(zhì)量分數(shù)(w)來計算，公式如下：

DS=(132×w)/(32-102×w)

式中： 132—玉米芯木聚糖分子中木糖單元的相對分子質(zhì)量； 102—木聚糖分子中1個羥基被取代后變?yōu)椤狾SO3Na時，相對分子質(zhì)量的增加值； 32—S的相對原子質(zhì)量；w—樣品中硫元素的質(zhì)量分數(shù)。

1.4.2 凝膠滲透色譜分析 通過凝膠滲透色譜(GPC)來測定木聚糖硫酸酯的相對分子質(zhì)量。檢測所用色譜柱型號為Waters styrage HT6，柱溫箱溫度為25 ℃，檢測器為SFD RI-2000示差折光檢測器，流動相為0.001 mol/L NaCl溶液，流速為1 mL/min，標準品為聚乙二醇，進樣量為20 μL，進樣質(zhì)量濃度0.2 g/L，在進樣分析前通過0.25 μm微孔濾膜過濾樣品。

1.4.3 紅外光譜分析 通過傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀對合成的木聚糖硫酸酯樣品進行紅外光譜分析，儀器的分辨率優(yōu)于4 cm-1，樣品的掃描次數(shù)為16次/s，掃描波數(shù)范圍為525～4000 cm-1。

1.4.4 元素分析 采用元素分析儀對玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯進行元素分析，主要測定C、H、O、S這4種元素的含量。

1.4.5 核磁共振分析 木聚糖硫酸酯的13C NMR使用核磁共振波譜儀進行分析，以D2O為溶劑。其中13C NMR 譜的掃描數(shù)為10 000，脈沖寬度為11.5 μs，延遲時間為2 s。

1.5 木聚糖硫酸酯的體外抗凝血活性測定

將健康的新鮮血液與3.8%檸檬酸鈉溶液按照體積比9 ∶1混合，4 ℃下離心沉淀(8 000 r/min，20 min)，收集上層清液，即為貧血小板血漿(PPP)，并于-20 ℃的冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆?。在進行抗凝血活性分析時，37 ℃恒溫融化，3 h內(nèi)使用。

使用APTT、PT和TT來表示木聚糖硫酸酯的抗凝血活性，并以商業(yè)普通肝素鈉做對比。首先，將木聚糖硫酸酯配制成不同質(zhì)量濃度的溶液。在37 ℃恒溫條件下，加入PPP，使之充分混合后，再分別加入APTT、PT和TT測定試劑。在37 ℃恒溫5 min后，加入已經(jīng)預熱的CaCl2溶液，并且在自動凝血計上記錄凝血時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖硫酸酯的合成條件優(yōu)化

硫酸鹽基團在多糖的抗凝血活性中起著重要作用，多糖的硫酸基取代度(DS)是生物活性的重要參數(shù)。本試驗以硫酸基的取代度(DS)為指標，以反應溫度(A)、時間(B)、SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比(C)和反應溶劑(D)為因素，設計4因素3水平正交試驗L9(34)，對合成工藝進行優(yōu)化，從而獲得高取代度的木聚糖硫酸酯。木聚糖硫酸酯合成工藝的正交試驗設計及結(jié)果分析如表1所示。由表1極差分析可知，各因素對取代度影響的順序依次為C>D>A>B，即SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比是影響木聚糖硫酸酯取代度的最顯著因素；最佳水平為A2B2C2D1，即以DMF為溶劑，反應溫度為55 ℃，時間為3 h，SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1。經(jīng)驗證實驗得到該條件下硫酸基取代度為1.53。以最佳條件下合成的木聚糖硫酸酯進行后續(xù)的結(jié)構(gòu)表征。

表1 木聚糖硫酸酯合成工藝的正交試驗設計及結(jié)果分析

為驗證正交試驗的結(jié)果，在DMF溶劑中，SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1條件下，考察了反應時間、反應溫度對取代度和木聚糖硫酸酯得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 反應時間和溫度對硫酸基取代度DS(a)和得率(b)的影響Fig.2 Effect of reaction time and temperature on the DS(a) and yield(b) of sulfate group

由圖2(a)可知，反應溫度為55 ℃時，硫酸基的取代度(DS)在0～3 h內(nèi)隨著硫酸化時間的延長而迅速增加，在3 h時達到最大值1.53，隨著反應時間的繼續(xù)延長，DS不再增加，反而略有下降。45 ℃也有相似的規(guī)律，但是45 ℃條件下測得的DS相對較小。因此，反應時間以3 h為宜。

由圖2(b)可知，反應溫度為55 ℃時，木聚糖硫酸酯的得率在最初反應的1 h內(nèi)隨著反應時間的延長而迅速增加，1 h的得率為68.2%，3 h的得率達到最大值78.2%，但繼續(xù)延長反應時間，木聚糖硫酸酯的得率有所減小。木聚糖為易降解多糖，在酸性條件下非常容易發(fā)生降解，另外隨著反應時間的延長，也導致產(chǎn)物顏色加深，故選擇反應時間為3 h。在4 h之前，45 ℃條件下木聚糖硫酸酯的得率均小于55 ℃的得率；但是隨著反應時間的延長，當反應5 h時45 ℃的得率高于55℃，這是因為溫度越高，木聚糖越容易降解，致使得率降低。

2.2 玉米芯木聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 GPC分析 硫酸多糖的相對分子質(zhì)量是影響生物活性的另一個重要參數(shù)。GPC分析發(fā)現(xiàn)，玉米芯木聚糖(圖3(a))和木聚糖硫酸酯(圖3(b))均呈現(xiàn)單一中心峰，表明它們近似于均聚體結(jié)構(gòu)，組成更加均一。玉米芯木聚糖的數(shù)均相對分子質(zhì)量為45 394、重均相對分子質(zhì)量為65 433、多分散系數(shù)為1.441，小于1.5，為結(jié)構(gòu)均一型的聚合多糖。木聚糖硫酸酯的數(shù)均相對分子質(zhì)量為30 852、重均相對分子質(zhì)量為36 754、多分散系數(shù)為1.191，小于1.5，為結(jié)構(gòu)均一型的多糖硫酸酯。韓亮等[16]以玉米芯木聚糖為原料，采用氯磺酸-吡啶法對木聚糖進行硫酸化改性，得到木聚糖硫酸酯的多分散系數(shù)大于1.5。所制備的木聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)不如本研究制備的多糖硫酸酯均一。此外，本研究得到的木聚糖硫酸酯的分子質(zhì)量小于玉米芯木聚糖的分子質(zhì)量，說明木聚糖的硫酸化過程中木聚糖分子鏈發(fā)生了斷裂。因此，如何控制木聚糖硫酸酯的相對分子質(zhì)量是今后研究的關鍵。

圖3 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的GPC分析Fig.3 GPC analyses of corn cob xylan(a) and xylan sulfate(b)

圖4 木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的FT-IR圖 Fig.4 FT-IR spectra of the xylan(a) and xylan sulfate(b)

表2 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的元素分析

2.2.3 元素分析 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的C、H、O、S這4種元素的含量如表2所示。由表2可知，經(jīng)硫酸化改性后，木聚糖硫酸酯中S含量增加的同時，H含量降低，說明硫酸根取代了木聚糖上的氫，由于S元素的增加，導致C元素所占比例有所下降，與2.2.2節(jié)紅外光譜分析結(jié)果相吻合。

2.2.413C NMR分析 對玉米芯木聚糖和玉米芯木聚糖硫酸酯進行了13C NMR分析，結(jié)果見圖5。由圖5(a)可知，玉米芯木聚糖的13C NMR譜中有δ101.90(C-1)、δ74.10(C- 4)、δ77.70(C-3)、δ76.04(C-2)和δ61.10(C-5)5個主要信號峰，為(1→ 4)-β-D-吡喃木聚糖。由圖5(b)可知，經(jīng)硫酸化改性后，13C NMR譜中C-1、 C-2、 C-3、 C- 4、 C-5的δ值分別變?yōu)?05.06、 75.10、 75.26、 78.58、 65.99。C-2和C-3向高場的方向偏移，表明C-2、C-3與呈電負性的硫酸酯基團直接相連。由于C-2和C-3的硫酸化作用，C-1、C- 4和C-5轉(zhuǎn)移到較低場[21-22]。

圖 5 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的13C NMR圖Fig.5 13C NMR spectra of the corncob xylan(a) and xylan sulfate(b)

2.3 體外抗凝血活性分析

酸化多糖的體外抗凝血活性采用經(jīng)典的APTT、PT和TT凝血分析評估測定，其中APTT主要用于分析評估內(nèi)源性凝血途徑，即在Ca2+存在下加入促凝血酶原激酶后形成凝塊所需的時間[23-24]，TT主要測定加入血漿后生成的凝血酸使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時間[13]，PT為凝血酶原時間，是血檢前狀態(tài)，DIC及肝病診斷的重要指標，作為外源性凝血系統(tǒng)的過篩試驗，也是臨床口服抗凝治療劑量控制的重要手段，主要用于評估外在途徑。

以所制備的玉米芯木聚糖為原料，當反應溫度為55 ℃、三氧化硫-吡啶絡合物與木糖單元羥基物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1時，硫酸酯化反應時間為1、2和3 h時，分別合成木聚糖硫酸酯XS-1、XS-2和XS-3，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液進行體外抗凝血活性測定，并與商業(yè)肝素鈉進行比較，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，與未加入任何凝血劑的空白對照組相比，加入木聚糖硫酸酯后APTT和TT均延長，但對PT的影響相對較小，這表明木聚糖硫酸酯具有抗凝血活性，可能是通過影響APTT和TT來發(fā)揮抗凝血作用的。同時，木聚糖硫酸酯的抗凝血活性隨著取代度和質(zhì)量濃度的增加而增加，高相對分子質(zhì)量、低取代度的木聚糖硫酸酯通過增加樣品質(zhì)量濃度，可以達到與低相對分子質(zhì)量、高取代度的木聚糖硫酸酯相當?shù)目鼓Ч?。從?可以看出，陽性對照組肝素鈉能夠顯著延長APTT，而木聚糖硫酸酯的抗凝血活性比肝素鈉弱，但是在較高質(zhì)量濃度的條件下XS-3可以達到與肝素鈉相近的抗凝血效果，這為木聚糖硫酸酯代替肝素鈉成為抗凝血劑提供了可能。由于木聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)與抗凝血性能之間存在復雜的關系，特別是不同取代度與相對分子質(zhì)量的相關性。因此，今后將重點研究木聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)與其功能的關系。

表3 木聚糖硫酸酯對APTT、PT和TT的影響

3 結(jié) 論

3.2 通過體外抗凝血活性測試發(fā)現(xiàn)，木聚糖硫酸酯可以延長APTT和TT，且抗凝血活性隨著取代度和質(zhì)量濃度的增加而增加，是一種有效的抗凝性物質(zhì)；同時，高取代度和高質(zhì)量濃度的木聚糖硫酸酯的抗凝血效果與陽性對照肝素鈉相近，表明木聚糖硫酸酯具有新型抗凝血劑的應用前景。