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      玉米PHYB1基因的克隆、改造及其在擬南芥中的功能分析

      2019-08-13 09:26:28馬曉凈趙斌斌馬夢(mèng)迪王海洋
      生物技術(shù)進(jìn)展 2019年4期
      關(guān)鍵詞:胚軸株系突變體

      馬曉凈, 趙斌斌, 劉 揚(yáng), 馬夢(mèng)迪, 王海洋

      1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京100081; 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642

      對(duì)于植物而言,光是重要的能量來(lái)源及環(huán)境信號(hào),幾乎貫穿于植物的一生,對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育極其重要[1]。植物主要依靠四類光受體感知光的變化,其中以紅光(R)及遠(yuǎn)紅光(FR)(600~750 nm)受體——光敏色素(phytochromes, phys)的研究最為透徹。光敏色素是含有一個(gè)線性四吡咯發(fā)色團(tuán)的同源二聚體,單體約120 kDa[2]。phyB在植物體內(nèi)以兩種可逆狀態(tài)存在,即有活性的FR吸收態(tài)——Pfr和非活性的R吸收態(tài)——Pr[3]。其通過(guò)與光敏色素互作因子(phytochrome interacting factors, PIFs)互作來(lái)行使其功能[4~7]。Nito等[8]認(rèn)為將擬南芥PHYB的104位酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可使其對(duì)紅光超敏感。Zhang等[9]研究表明,將擬南芥PHYB N端361位的酪氨酸(Y)殘基突變?yōu)楸奖彼?F)殘基可增強(qiáng)其活性。

      同時(shí),光敏色素B還是避蔭反應(yīng)的抑制因子[10]。避蔭反應(yīng)是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程[11~12],通常認(rèn)為紅光與遠(yuǎn)紅光的比例(R:FR)下降是觸發(fā)避蔭反應(yīng)的因素。密植后(遮陰)植物之間相互遮擋,由于植物葉片對(duì)有效光的截留、吸收及反射等影響導(dǎo)致底層紅光與遠(yuǎn)紅光比例下降(低R:FR),而影響植物的光合作用。在低R:FR生長(zhǎng)條件下,擬南芥表現(xiàn)為莖和葉柄伸長(zhǎng)、葉片上翹、葉面積變小、分枝減少、早花、根系弱、易感病、抗逆性減弱等適應(yīng)性特征,這些反應(yīng)統(tǒng)稱為避蔭反應(yīng)(shade avoidance response, SAR)[13~15]。

      在低R:FR生長(zhǎng)條件下,單子葉植物也會(huì)出現(xiàn)莖稈徒長(zhǎng)、分蘗顯著減少、產(chǎn)量下降、易倒伏、雌雄間隔增大等特征。并且玉米中的phyB1phyB2雙突變體和高粱中的phyB突變體與擬南芥中的phyB突變體類似,均表現(xiàn)出避蔭反應(yīng)的特征,如植株增高、節(jié)間增長(zhǎng)、易倒伏、分蘗減少、早花等[16~19]。這一結(jié)果表明,phyB也是禾本科植物中調(diào)控避蔭反應(yīng)的主要光受體[20]。目前擬南芥中遮蔭反應(yīng)分子機(jī)理的研究已經(jīng)相當(dāng)完善,但在禾本科植物中的研究還十分有限[19]。因此研究玉米的光敏色素B對(duì)于了解玉米避蔭反應(yīng)及光敏色素在單、雙子葉植物避蔭反應(yīng)中的功能差異十分重要。

      玉米(ZeamaysL.)由于廣適性、高產(chǎn)、用途多樣等特點(diǎn),在全球范圍內(nèi)被廣泛種植。2012年玉米已成為我國(guó)第一大谷物。研究表明[21],我國(guó)玉米單產(chǎn)水平與美國(guó)等國(guó)家相去甚遠(yuǎn)。Duvick等[22]研究發(fā)現(xiàn)增加單位面積玉米的種植密度以增加果穗數(shù)是提高玉米單產(chǎn)的有效途徑,但目前我國(guó)玉米的種植密度僅為美國(guó)的60%左右。因此,我國(guó)在玉米種植密度上還有很大的提升空間。但在高密度種植情況下,避蔭反應(yīng)綜合征是限制玉米產(chǎn)量提高的主要因素,因此解析避蔭反應(yīng)關(guān)鍵基因光敏色素的功能,對(duì)于深入了解玉米光信號(hào)遺傳網(wǎng)絡(luò)、指導(dǎo)玉米新品種培育具有重要作用。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 玉米自交系B73、擬南芥野生型Col-0、擬南芥突變體phyB-9、本生煙草(N.benthamiana)為本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、P19菌株、AT-Hook菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存;改造后的pCAMBIA載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

      1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105-03)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106-02)、通用型DNA純化回收試劑盒(DP214-03)、熒光定量試劑盒(FP205-02)購(gòu)于天根生化科技公司;Trizol試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾試劑公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司和NEB公司;In-fusion HD Cloning Kit購(gòu)于Clontech公司;KOD Fx PCR擴(kuò)增酶購(gòu)于ToYoBo公司等。

      1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 TC-XP型PCR儀購(gòu)于廣州博日科技公司;Quant Studio 3實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于ABI公司;Tanon-100一體化凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于上海天能公司;低溫離心機(jī)購(gòu)于Eppendorf公司;NANO DROP 2000C購(gòu)于Thermo公司;三色光植物培養(yǎng)箱購(gòu)于PERCIVA公司;Stemi 508型體視顯微鏡購(gòu)于蔡司公司;LB985型植物活體成像儀購(gòu)于Berthold Technologies公司等。

      1.2 方法

      1.2.1序列獲得 在Tair數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)和MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.maizegdb.org/)中下載擬南芥及玉米光敏色素蛋白質(zhì)序列。

      1.2.2組織表達(dá)分析 利用Trizol法提取RNA;反轉(zhuǎn)錄(詳見(jiàn)天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106-02)說(shuō)明書(shū));轉(zhuǎn)基因株系中外源基因ZmPHYB1的表達(dá)量檢測(cè)利用引物qPHYB1-F/R(表1),內(nèi)參引物參考Liu等[23]的引物序列,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(操作詳見(jiàn)天根熒光定量試劑盒(FP205-02)說(shuō)明書(shū))。

      1.2.3ZmPHYB1序列的克隆及改造 利用CTAB法[24]提取DNA,RNA提取同1.2.2。在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.maizegdb.org/)中檢索PHYB1(GRMZM2G124532)基因并下載其序列信息,設(shè)計(jì)克隆及位點(diǎn)改造所需的引物(引物序列見(jiàn)表1)。ZmPHYB1啟動(dòng)子(pZmPHYB1)由引物ZmPHYB1-pro-F/ZmPHYB1-pro-R以自交系B73基因組DNA為模板進(jìn)行克??;野生型ZmPHYB1(ZmPHYB1WT)編碼序列(CDS)由引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R以自交系B73的cDNA為模板克隆。為了得到序列ZmPHYB1Y98F,ZmPHYB1Y359F(兩個(gè)位點(diǎn)的確定詳見(jiàn)2.1),通過(guò)重疊PCR的方法進(jìn)行克隆。具體操作如下:以ZmPHYB1WT為模板,利用引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-98-R和ZmPHYB1-98-F/ZmPHYB1-R,分別進(jìn)行富集,純化回收,混合后作為模板。再以ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R進(jìn)行重疊PCR,獲得ZmPHYB1Y98F;以同樣的方法獲得ZmPHYB1Y359F。

      1.2.4轉(zhuǎn)基因及鑒定 將pZmPHYB1與ZmPHYB1WT、ZmPHYB1Y98F及ZmPHYB1Y359F分別融合,與改造后的pCAMBIA載體重組獲得重組子。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥中研究其功能。轉(zhuǎn)基因采用擬南芥花序浸染法[25];轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定采用噴灑Basta篩選法及特異引物PCR檢測(cè)法。特異引物PCR檢測(cè)法具體操作如下,提取轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA為模板,以鑒定引物ZmPHYB1-identify-FP/RP(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,若為陽(yáng)性植株則可見(jiàn)1.4 kb大小條帶,陰性植株則無(wú)此條帶。

      1.2.5表型統(tǒng)計(jì)及分析 主要觀測(cè)的表型包括下胚軸長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度、葉片長(zhǎng)度等。每個(gè)材料取30株進(jìn)行表型的測(cè)量及統(tǒng)計(jì),采用t測(cè)驗(yàn)(Student’sttest)進(jìn)行顯著性分析。下胚軸長(zhǎng)度測(cè)量:人工氣候室(光照/黑暗:16 h/8 h)培養(yǎng)6~7 d后,體視顯微鏡下觀察、拍照;用Image J軟件測(cè)量30株幼苗的下胚軸,統(tǒng)計(jì)分析;葉柄長(zhǎng)度及葉片長(zhǎng)度測(cè)量:取在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)2~3周材料的第3、4片葉,相機(jī)拍照;Image J軟件測(cè)量30個(gè)單株的葉柄長(zhǎng)度及葉片長(zhǎng)度,統(tǒng)計(jì)分析。

      1.2.6蛋白互作研究 采用熒光素酶互補(bǔ)成像(firefly luciferase complementation imaging assay, LCI)實(shí)驗(yàn)[23]進(jìn)行驗(yàn)證。

      表1 本研究所用引物Table 1 Primers for the study.

      2 結(jié)果與分析

      2.1 玉米PHYB1改造位點(diǎn)的確定

      已有研究發(fā)現(xiàn),把擬南芥PHYB的104位與361位的酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可以提高擬南芥phyB的活性[8,9]。下載擬南芥、玉米、水稻、大豆、高粱等的PHYB全蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如圖1所示,通過(guò)序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)在以上物種中,這兩個(gè)位點(diǎn)十分保守。最終我們確定玉米中的98位和359位酪氨酸(Y)殘基分別與擬南芥中104位和361位酪氨酸(Y)殘基相對(duì)應(yīng)。

      圖1 氨基酸突變位點(diǎn)Fig.1 Amino acid mutation sites.ZmPHYB1:玉米PHYB1;SbPHYB:高粱PHYB;ZmPHYB2:玉米PHYB2;OsPHYB:水稻PHYB;AtPHYB:擬南芥PHYB;GmPHYB:大豆PHYB。

      2.2 轉(zhuǎn)基因單拷貝純合株系的篩選

      將構(gòu)建好的pZmPHYB1∷ZmPHYB1WT,pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y98F和pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y359F三種重組子分別轉(zhuǎn)入擬南芥phyB-9突變體中。采用噴灑Basta溶液的方法,篩選陽(yáng)性植株。最終得到單基因插入的純合轉(zhuǎn)基因植株,收取種子待用。為了確定轉(zhuǎn)基因純合株系的真實(shí)性,對(duì)以上植株進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可見(jiàn)

      1.4 kb的條帶,而野生型(Col-0)及phyB-9無(wú)該條帶,如圖2。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們最終得到了確切的單基因插入的轉(zhuǎn)基因純合株系。

      圖2 PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系Fig.2 PCR identification of positive lines.

      2.3 表達(dá)分析

      為了得到ZmPHYB1基因的表達(dá)圖譜,在線搜索了ZmPHYB1的RNA-Seq數(shù)據(jù)[26],并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3A所示;同時(shí)針對(duì)2.2中得到的純合轉(zhuǎn)基因株系我們還進(jìn)行了外源基因ZmPHYB1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),結(jié)果如圖3B所示。通過(guò)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZmPHYB1基因在根、莖(節(jié)間)、葉、頂端分生組織(SAM)、雄穗、花絲等組織中均有表達(dá),但主要在葉子中表達(dá),尤其是在V9時(shí)期的第13片葉及未成熟葉片中表達(dá)量最高。此結(jié)果與光敏色素基因光受體的功能相符。由圖3B還可以發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因株系中,轉(zhuǎn)入的外源ZmPHYB1可在phyB-9突變體中表達(dá)。

      圖3 ZmPHYB1基因的表達(dá)情況 Fig.3 The expression of ZmPHYB1.A.ZmPHYB1基因在玉米不同組織中的表達(dá)情況;B.擬南芥各轉(zhuǎn)基因株系中ZmPHYB1的表達(dá)水平。WT#1/2、Y98F#16/24、Y359F#3/12名稱中“#”后面的數(shù)字表示轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)。

      2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型分析

      2.4.1轉(zhuǎn)基因株系下胚軸長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析 如圖4A所示,phyB-9突變體的下胚軸顯著長(zhǎng)于各轉(zhuǎn)基因株系及野生型。圖4B中統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也同樣證實(shí)上述結(jié)果。對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行分析可以得出:①轉(zhuǎn)入外源基因ZmPHYB1可以使phyB-9突變體的下胚軸長(zhǎng)度部分或完全恢復(fù)到野生型水平,即抑制突變體下胚軸伸長(zhǎng);②經(jīng)過(guò)位點(diǎn)改造的轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸短于未經(jīng)過(guò)位點(diǎn)改造的轉(zhuǎn)基因株系。綜上所述,ZmPHYB1與擬南芥中phyB具有相似的功能。并且Y98F和Y359F氨基酸的替換可增強(qiáng)ZmPHYB1的活性,此結(jié)果與前人在擬南芥中的研究相符[8]。

      圖4 轉(zhuǎn)基因株系表型Fig.4 Phenotype of transgenic lines.注:A.長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)6天的植株的表型;B.長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)兩周的葉片形態(tài);C.長(zhǎng)日照條件下,下胚軸長(zhǎng)度的測(cè)量及統(tǒng)計(jì);D.長(zhǎng)日照條件下,第三、四片真葉葉片長(zhǎng)度的測(cè)量及統(tǒng)計(jì);E.長(zhǎng)日照條件下,第三、四片真葉葉柄長(zhǎng)度的測(cè)量及統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺為1 mm;**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.01水平上差異顯著(t檢驗(yàn),n=30)。

      2.4.2轉(zhuǎn)基因株系葉片長(zhǎng)度與葉柄長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析 在長(zhǎng)日照生長(zhǎng)條件下,phyB-9突變體一般只有4片蓮座葉且其葉片及葉柄顯著伸長(zhǎng),因此我們選取Col-0、phyB-9、轉(zhuǎn)基因株系的第3、4片葉,對(duì)其葉片長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),如圖4C-E所示。從以上結(jié)果可以看出,轉(zhuǎn)基因株系的葉片長(zhǎng)度及葉柄長(zhǎng)度均顯著短于突變體phyB-9,即在擬南芥phyB-9突變體中轉(zhuǎn)入外源ZmPHYB1后,轉(zhuǎn)基因材料的葉片及葉柄變短。由此可見(jiàn),ZmPHYB1可以抑制phyB-9突變體的伸長(zhǎng)反應(yīng)(下胚軸、葉片及葉柄的伸長(zhǎng)),這說(shuō)明該基因可能是避蔭反應(yīng)的抑制因子。

      2.5 ZmPHYB1與AtPIF5互作

      研究表明,擬南芥的phyB可以直接與光敏色素互作因子(PIFs)互作[5]。前期實(shí)驗(yàn)表明,ZmPHYB1與擬南芥phyB在功能上存在一定的保守性。推測(cè)其通過(guò)與擬南芥PIFs互作而行使功能。借助熒光素酶互補(bǔ)成像技術(shù),可驗(yàn)證玉米PHYB1是否與擬南芥PIFs互作。選取AtPIF5為代表進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,三種形式的ZmPHYB1(PHYB1WT、PHYB1Y98F、PHYB1Y359F)均可以與AtPIF5互作(圖5),表明ZmPHYB1在擬南芥中可與AtPIF5互作,進(jìn)一步驗(yàn)證了ZmPHYB1與擬南芥PhyB在功能上的保守性。

      2.6 轉(zhuǎn)基因株系中避蔭反應(yīng)響應(yīng)基因及生長(zhǎng)素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)模式

      phyB是擬南芥中響應(yīng)避蔭反應(yīng)的主要光受體,為了驗(yàn)證ZmPHYB1是否參與擬南芥的避蔭反應(yīng),我們對(duì)避蔭反應(yīng)信號(hào)通路中的一些重要響應(yīng)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。如圖6所示,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)避蔭反應(yīng)中的marker基因(ATHB2)與生長(zhǎng)素合成marker基因(YUC5)在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)模式,對(duì)結(jié)果分析可以看出,擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中ATHB2及YUC5的表達(dá)量均顯著低于phyB-9突變體中的表達(dá)量,但均高于野生型,這也從一個(gè)側(cè)面解釋了我們的轉(zhuǎn)基因株系為什么不能完全互補(bǔ)phyB-9突變體表型。以上結(jié)果進(jìn)一步表明ZmPHYB1在擬南芥中可以行使PHYB的功能——抑制伸長(zhǎng)反應(yīng)。

      圖5 LCI驗(yàn)證ZmPHYB1與AtPIF5互作Fig.5 LCI verifies the interaction between ZmPHYB1 and AtPIF5.

      圖6 下游響應(yīng)基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of downstream shade responsive genes.A.ATHB2表達(dá)量變化;B.YUC5表達(dá)量變化。*和**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.05和P<0.01的水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

      3 討論

      在雙子葉模式植物擬南芥中PHYB具有抑制避蔭反應(yīng)的功能[27~29]。在禾本科植物中PHYB也是調(diào)控避蔭反應(yīng)的主要光受體,但其在玉米避蔭反應(yīng)調(diào)控的遺傳網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)理鮮有研究[19,30~31]。本研究表明ZmPHYB1與擬南芥PhyB存在功能保守性,并且ZmPHYB1可以參與調(diào)控?cái)M南芥的避蔭反應(yīng)。

      作物的避蔭反應(yīng)是一種適應(yīng)性反應(yīng),但其對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分不利。育種家經(jīng)過(guò)不斷地實(shí)踐和總結(jié),提出作物耐密理想株型以減弱或消除避蔭反應(yīng)。理想株型指標(biāo)包括小雄穗、堅(jiān)莖稈、株高適宜等[32]。張世煌[33]指出,高密度育種的首要目標(biāo)在于增強(qiáng)自交系和雜交種的耐密植等抗逆性。研究表明[34],玉米的莖稈徒長(zhǎng)(株高增加)是玉米避蔭反應(yīng)綜合征的典型特征。此外,避蔭反應(yīng)所導(dǎo)致的植株徒長(zhǎng)還會(huì)加重倒伏的發(fā)生以及減產(chǎn)[35]。陳德龍[36]認(rèn)為,株高和穗位高與倒伏是高度正相關(guān)的。本研究結(jié)果表明ZmPHYB1可以抑制擬南芥的伸長(zhǎng)反應(yīng),故而推測(cè)在轉(zhuǎn)基因玉米中同樣會(huì)出現(xiàn)株高降低、穗位高降低等表型。擬南芥Y104F(對(duì)應(yīng)玉米Y98F突變)氨基酸的替換可增加植株對(duì)紅光的敏感性[8],因此推測(cè)玉米Y98F氨基酸的替換也可以使玉米對(duì)紅光超敏,進(jìn)而減弱由于密植造成的避蔭反應(yīng)。擬南芥Y361F(對(duì)應(yīng)玉米Y359F突變)氨基酸的替換,可以加速PhyB由非活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问絒9],因此在Y359F殘基替換的轉(zhuǎn)基因株系中PhyB的活性形式積累,降解避蔭反應(yīng)促進(jìn)因子——PIFs,增強(qiáng)了玉米的耐密性。

      總之,本研究為耐密植玉米新品種的培育提供了參考,同時(shí)也可以啟發(fā)育種工作者篩選這兩個(gè)位點(diǎn)的自然變異,以改良玉米的株高、穗位高以及增強(qiáng)耐密性。

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