小麥花粉育性檢測(cè)和花粉致死基因攜帶種質(zhì)的鑒定

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國(guó)家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)第二大糧食作物，其產(chǎn)量直接影響糧食平衡。因此提高小麥產(chǎn)量，降低小麥生產(chǎn)成本，提高國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力成為我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和和社會(huì)發(fā)展課題中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。在生物界中，雜種優(yōu)勢(shì)是一種普遍現(xiàn)象，利用雜種優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)作物的高產(chǎn)育種已在玉米、水稻等作物中取得顯著成果。但是在利用作物雜種優(yōu)勢(shì)研究中發(fā)現(xiàn)，2個(gè)完全結(jié)實(shí)正常的品種雜交后，其F1代植株常常表現(xiàn)異常，如葉片壞死、植株黃化甚至枯萎、個(gè)體矮小、結(jié)實(shí)明顯下降等癥狀。Sax[1]在研究小麥雜種的不育性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bluestem/Amby的正交和反交F1在苗期初期表現(xiàn)正常，當(dāng)株高達(dá)到15～20 cm時(shí)植株生長(zhǎng)停滯、過(guò)度分蘗，隨后死亡。Loegering等[2]和Sears等[3]在普通小麥品種“中國(guó)春”和澳大利亞春小麥品種“Timstein”的雜交F1植株上發(fā)現(xiàn)，大約有50%花粉敗育。在玉米中，ZmAA1基因被報(bào)道為花粉致死基因，編碼了一個(gè)α-淀粉酶蛋白，該蛋白屬于家族糖基水解酶，可催化水解多糖分子(1-4)-α-D-糖苷鍵，通過(guò)特異干擾花粉中淀粉的正常積累，從而抑制花粉正常發(fā)育最終導(dǎo)致花粉發(fā)育夭折[4-5]。Chang等[6]在水稻中發(fā)現(xiàn)OsNP1的隱性核雄性不育基因。OsNP1編碼假定的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，該酶調(diào)節(jié)絨氈層的降解和花粉外壁形成；主要在絨氈層和小孢子中表達(dá)。osnp1突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)正常，但完全不育，并對(duì)環(huán)境條件不敏感。在小麥中，王鵬等[7]以中國(guó)春和澳大利亞春小麥品種的BC1F1代作為定位群體對(duì)花粉致死基因Ki進(jìn)行分子標(biāo)記定位，并將Ki基因定位于6 B染色體長(zhǎng)臂上，但篩選得到的2個(gè)遺傳標(biāo)記距離較遠(yuǎn)，其可靠性有待驗(yàn)證。

本研究試圖通過(guò)組配多個(gè)雜交組合，鑒定花粉敗育情況，從而證明花粉致死遺傳模式在冬小麥品種中也是一種普遍存在的現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)攜帶花粉致死基因的種質(zhì)進(jìn)行鑒定，以期為進(jìn)一步克隆小麥花粉致死基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用155個(gè)小麥雜交組合F1及其親本，中國(guó)春(攜帶顯性花粉致死基因Ki)，寧春4號(hào)和寧春16號(hào)小麥品種(攜帶隱性花粉致死基因ki[7])均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥生殖發(fā)育與雜優(yōu)利用課題組提供。

1.2 方 法

1.2.1材料種植

試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。2015年4月選取62個(gè)小麥品種(系)通過(guò)人工去雄、授粉共組配155個(gè)雜交組合。 10月將F0種植于試驗(yàn)地，每個(gè)組合種植2行，行長(zhǎng)1 m，行距25 cm，株距10 cm。2016年4月在小麥開(kāi)花期取所有組合成熟花藥用1% KI-I2染色，鑒定花粉育性。2016年11月，將經(jīng)過(guò)鑒定具有半不育花粉育性F1組合的親本以及帶有花粉致死基因的中國(guó)春、寧春4號(hào)、寧春16號(hào)種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥中心溫室，通過(guò)人工去雄、授粉配制組合，收取F0種子。2017年3月將春化后的F1種植于大田，5月在小麥開(kāi)花期取成熟花藥用1% KI-I2溶液染色鑒定花粉育性。

1.2.2KI-I2溶液的配制

取2 g KI溶于5～10 mL蒸餾水中，然后加入1 g I2，待全部溶解后，再加蒸餾水定容至300 mL。貯于棕色瓶中備用。

1.2.3小麥花粉育性的檢測(cè)

采集小麥成熟花藥置于干凈的載玻片上，然后用鑷子將花藥充分搗碎，使花粉釋放，然后在破碎組織上滴1～2滴1% KI-I2溶液，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸掉多余溶液，隨后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。觀察3個(gè)穗子(來(lái)自不同植株)，每個(gè)穗子觀察3朵小花，每片取3個(gè)視野。以目測(cè)不育花粉粒約占總花粉粒的50%為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)所有的F1組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉育性檢測(cè)

在小麥開(kāi)花期，取成熟花藥用KI-I2溶液染色，對(duì)可育花粉、不育花粉以及半不育花粉進(jìn)行鏡檢觀察。可育花粉粒染色呈深藍(lán)色圓形，花粉粒較大(圖1 A)。不育花粉粒較小，不規(guī)則，且染不上色(圖1 B)。半不育花粉中，一半的花粉粒呈深藍(lán)色圓形，花粉粒較大；另外一半的花粉粒較小，不規(guī)則，且染不上色，呈現(xiàn)敗育狀態(tài)(圖1 C)。

2.2 小麥雜交組合F1的花粉育性檢測(cè)

為了研究Loegering等[2]發(fā)現(xiàn)的春小麥花粉致死現(xiàn)象在普通冬小麥中是否也普遍存在，本研究選取了155個(gè)F1雜交組合，通過(guò)KI-I2溶液觀察成熟花藥。研究表明，大多數(shù)F1組合的花粉表現(xiàn)為可育花粉粒狀態(tài)，呈深藍(lán)色圓形，花粉粒較大。但是有4個(gè)F1組合的花粉表現(xiàn)為半不育花粉狀態(tài)，一半花粉粒呈深藍(lán)色圓形，花粉粒較大；另外一半的花粉粒較小，不規(guī)則，染不上色。它們分別是西農(nóng)9718/鑫農(nóng)516，西農(nóng)9817/周麥22，西農(nóng)9817/西農(nóng)509，西農(nóng)261/存麥4號(hào)(圖2)。

注：A為西農(nóng)9817/鑫農(nóng)516；B為西農(nóng)9817/周麥22；C為西農(nóng)9817/西農(nóng)509；D為西農(nóng)2611/存麥4號(hào)。Bar=0.5 mm。圖2 小麥雜交組合F1花粉活性

注：A為可育花粉；B為敗育花粉；C為半不育花粉。Bar=0.5 mm。圖1 KI-I2染色檢驗(yàn)花粉活性

2.3 攜帶花粉致死基因品種及雜交組合的鑒定

Loegering等[2]Sears等[3]研究發(fā)現(xiàn)，小麥品種“中國(guó)春”的6 B染色體長(zhǎng)臂上攜帶有顯性花粉致死基因Ki，而澳大利亞春小麥品種“Timstein”攜帶有相應(yīng)的隱性花粉致死等位基因ki，它們的雜交后代中，F(xiàn)1代出現(xiàn)了50%的花粉敗育現(xiàn)象。王鵬等[7]利用“中國(guó)春”和“Timstein”鑒定出在普通春小麥品種寧春4號(hào)和寧春16號(hào)攜帶有隱性花粉致死等位基因ki。因此本研究以中國(guó)春和寧春4號(hào)、寧春16號(hào)與4個(gè)花粉表現(xiàn)均為半不育F1組合的親本分別雜交獲得相應(yīng)F1，用KI-I2溶液為染料，對(duì)其成熟花藥染色鑒定，從而鑒定攜帶花粉致死基因種質(zhì)；鑒定標(biāo)準(zhǔn)為，對(duì)以中國(guó)春小麥品種為母本的雜交組合F1植株花粉育性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)其花粉不育率為50%時(shí)，則證明該組合相應(yīng)父本品種攜帶等位隱性ki基因；對(duì)以寧春4號(hào)、寧春16小麥品種為母本的雜交組合F1植株花粉育性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)其花粉不育率為50%時(shí)，則證明該組合相應(yīng)父本品種攜帶等位顯性Ki基因。結(jié)果(圖3，表1)表明，西農(nóng)261和西農(nóng)9817攜帶顯性Ki基因，鑫農(nóng)516，周麥22，西農(nóng)509和存麥4號(hào)攜帶相應(yīng)等位隱性ki基因。

注：A為存麥4號(hào)；B為西農(nóng)2611/存麥4號(hào)；C為西農(nóng)2611；D為存麥4號(hào)/CS；E為西農(nóng)2611/寧春4號(hào)。Bar=0.5 mm。圖3 攜帶花粉致死基因品種的花粉育性鑒定性

3 討 論

保障糧食安全始終是我國(guó)農(nóng)業(yè)科技現(xiàn)階段的重要任務(wù)。目前，農(nóng)作物育種技術(shù)中最廣泛應(yīng)用、最有效的技術(shù)之一就是雜交育種技術(shù)。雜交水稻、雜交油菜、雜交玉米等對(duì)世界糧食起著十分重要的貢獻(xiàn)。雜交小麥的實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用，也必將對(duì)世界糧食供給起著巨大的作用。目前，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)雜交種生產(chǎn)途徑有細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)系為基礎(chǔ)的三系雜交、光溫敏雄性不育(PTGMS)系為基礎(chǔ)的兩系雜交、化學(xué)殺雄(CHA)為基礎(chǔ)的兩系雜交、人工去雄為基礎(chǔ)的兩系雜交。盡管以上途徑應(yīng)用廣泛，但是仍然存在一些固有的問(wèn)題。CMS系統(tǒng)包括恢復(fù)系的種質(zhì)資源狹窄，生產(chǎn)成本高、CMS系和恢復(fù)系之間的遺傳差異較少等問(wèn)題限制了CMS雜交育種的進(jìn)一步發(fā)展[9]；PTGMS系統(tǒng)種子的繁殖和雜交種子的生產(chǎn)，需要嚴(yán)格的環(huán)境條件，易受環(huán)境變化的影響[10]；CHA系統(tǒng)則不可避免的涉及到環(huán)境污染的問(wèn)題[11]；人工去雄為基礎(chǔ)的兩系雜交，則難以降低種子生產(chǎn)成本。核雄性不育(包括顯性和隱性)在開(kāi)花植物中是很常見(jiàn)的，但是在雜種優(yōu)勢(shì)利用中一直無(wú)法實(shí)現(xiàn)，該類型不育系用于商業(yè)化生產(chǎn)雜交種子中的主要問(wèn)題是難以獲得穩(wěn)定的雄性不育保持系[11]。Driscoll[13]則設(shè)想出XYZ體系生產(chǎn)雜種小麥，但未獲成功。1988年，黃壽松等[14-16]首創(chuàng)出附加型藍(lán)標(biāo)小麥核雄性不育，將長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyronelongatum)4 E染色體附加到小麥核型雄性不育系上(該4 E染色體上攜帶有藍(lán)色胚乳基因和育性恢復(fù)基因)，從而選育出由藍(lán)色胚乳性狀標(biāo)記的小麥核雄性不育、保持系，簡(jiǎn)稱為藍(lán)標(biāo)型(或BM型)小麥雄性不育、保持系。該體系中，淺藍(lán)粒種子植株自交結(jié)實(shí)后粒色分離為深藍(lán)、淺藍(lán)和白色3種，其中，占3%左右的深藍(lán)色籽粒種子長(zhǎng)出的植株自交結(jié)實(shí)，粒色為深藍(lán)色，不分離；白色籽粒種子占64%左右，長(zhǎng)出的植株全部表現(xiàn)為雄性不育，粒色不分離；而淺藍(lán)色籽粒種子占33%左右，長(zhǎng)出的植株仍然自交結(jié)實(shí)，粒色仍然分離為深藍(lán)、淺藍(lán)和白色3種。這樣白粒種子長(zhǎng)出雄性不育植株，可用來(lái)配制組合生產(chǎn)雜交種種子；而淺藍(lán)粒種子的植株則可以用來(lái)進(jìn)一步繁殖雄性不育系和保持系種子。1998年，李中安[17]創(chuàng)制了易位型藍(lán)標(biāo)小麥核雄性不育，將緊密連鎖的藍(lán)色胚乳基因和育性恢復(fù)基因易位到“Probus”核雄性不育系4 BS染色體上，雜交種生產(chǎn)原理同附加型藍(lán)標(biāo)小麥核雄性不育。這種雜交種生產(chǎn)體系解決了小麥核基因控制的雄性不育系在生產(chǎn)中難以獲得穩(wěn)定的保持系，難以獲得大量純合雄性不育系種子的問(wèn)題。但是，在以淺藍(lán)粒作為保持系的自交繁殖群體中，存在3%左右的深藍(lán)粒，從而影響了不育系的繁殖效率。據(jù)此，王鵬等[7]提出將花粉致死基因ki轉(zhuǎn)到4 E染色體上，從而藍(lán)粒標(biāo)記基因、雄性可育基因Ms和花粉致死基因ki被緊密連鎖在一起，使4 E單價(jià)體無(wú)法通過(guò)雄配子傳遞，這樣就能徹底解決深藍(lán)粒的存在問(wèn)題。

表1 攜帶花粉致死基因小麥種質(zhì)鑒定

品種和組合花粉育性攜帶花粉致死基因中國(guó)春可育Ki寧春4號(hào)可育ki寧春16號(hào)可育ki西農(nóng)261可育Ki西農(nóng)9817可育Ki存麥4號(hào)可育ki鑫農(nóng)516可育ki周麥22可育ki西農(nóng)509可育ki中國(guó)春/西農(nóng)261可育中國(guó)春/西農(nóng)9817可育中國(guó)春/西純4號(hào)半不育中國(guó)春/鑫農(nóng)516半不育中國(guó)春/周麥22半不育中國(guó)春/西農(nóng)509半不育西農(nóng)261/寧春4號(hào)半不育西農(nóng)9817/寧春16號(hào)半不育西純4號(hào)/寧春16號(hào)可育鑫農(nóng)516/寧春16號(hào)可育周麥22/寧春16號(hào)可育西農(nóng)509/寧春16號(hào)可育西農(nóng)9817/寧春16號(hào)可育

Loegering等[2]研究發(fā)現(xiàn)，“中國(guó)春”與澳大利亞春小麥品種“Timstein”雜交后，F(xiàn)1植株花粉不育率為1/2，由此提出小麥花粉致死基因的單基因遺傳模式。Kato等[8]研究認(rèn)為，小麥品種間雜交F1植株中，花粉不育率不是1/2，而是1/4或1/8，并且由此提出小麥花粉致死性狀是由3個(gè)分別命名為Ki2，Ki3和Ki4的互補(bǔ)基因控制的。本研究通過(guò)組配155個(gè)F1雜交組合，在小麥開(kāi)花期對(duì)成熟花藥用1% KI-I2染色觀察，證明這種花粉致死現(xiàn)象在普通小麥中是廣泛存在的。并且分別以“中國(guó)春”、寧春4號(hào)、寧春16號(hào)春小麥品種為母本的雜交組合，對(duì)花粉致死基因做了遺傳模式分析，發(fā)現(xiàn)不同組合雜交后，存在花粉異常的F1植株的花粉不育率都為1/2，該結(jié)果與之前Loegering和Sears等[2-3]研究結(jié)果一致，由此說(shuō)明花粉致死基因在普通小麥品種中為單基因遺傳模式[7]。

2009年美國(guó)先鋒公司利用玉米SPT制種技術(shù)，構(gòu)建了Ms 45-ZmAA1-DsRed 2基因盒的表達(dá)載體，對(duì)花粉致死基因ZmAA1及啟動(dòng)子Pg47應(yīng)用其中。選種時(shí)通過(guò)光電篩選機(jī)利用DsRed紅色熒光挑選種子，可滿足全程機(jī)械操作且繁殖時(shí)只需隔離自交，成功解決了核雄性不育兩系法運(yùn)用中的問(wèn)題[18]。利用花粉致死基因?qū)е聰y帶有外源育性基因的雄配子死亡，使轉(zhuǎn)基因元件不會(huì)遺傳給雜交后代，因此有效地解決了受到全球爭(zhēng)議的轉(zhuǎn)基因食品的安全性問(wèn)題[19]。與上述技術(shù)類似，Chang等[6]利用水稻隱性核不育基因OsNP1與一個(gè)α-淀粉酶基因和紅色熒光蛋白(DsRed)基因相結(jié)合，構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化osnp1突變體，這樣攜帶單合子轉(zhuǎn)基因水稻自交，可產(chǎn)生1∶1的比例雄性不育種子和轉(zhuǎn)基因的可育種子，其中轉(zhuǎn)基因種子可利用DsRed紅色熒光挑選出來(lái)，雄性不育種子作為不育系可用來(lái)生產(chǎn)雜交種。這樣的新型不育系兼具三系法的穩(wěn)定性和兩系法配組靈活性的優(yōu)點(diǎn)，被稱為 “第三代雜交育種技術(shù)”(G 3育種技術(shù))[19]。

花粉致死基因在今后作物分子設(shè)計(jì)不育系技術(shù)研究中將起到十分重要的作用，突破作物雜交育種分子設(shè)計(jì)技術(shù)，創(chuàng)制出不受環(huán)境限制的、穩(wěn)定的、具有恢復(fù)功能的新型不育系，實(shí)現(xiàn)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)的新變革。