不同浸提時(shí)間下野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻的影響研究

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

魚和漁業(yè)產(chǎn)品能夠提供維持人體健康的蛋白質(zhì)和必須微量元素，對(duì)維持人體營(yíng)養(yǎng)均衡有重要意義。水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為增加魚類供應(yīng)的主要途徑和動(dòng)物食品中增加最快的行業(yè)[1]。2018年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒的數(shù)據(jù)顯示：淡水養(yǎng)殖的水產(chǎn)品占淡水產(chǎn)品產(chǎn)量的93.01%，淡水養(yǎng)殖面積占水產(chǎn)養(yǎng)殖總面積的72.02%。其中池塘養(yǎng)殖面積最大，占總的淡水養(yǎng)殖面積的47.12%。因此，在我國(guó)，池塘養(yǎng)殖是一種重要的淡水養(yǎng)殖形式。

池塘養(yǎng)殖中，一個(gè)健康的藻相尤其重要，藻相的形成和變化主要由浮游生物，特別是浮游植物的變動(dòng)引起[2]。健康的池塘藻相主要含硅藻和綠藻[3]。但是由于集約化養(yǎng)殖，過量投喂，管理不科學(xué)等，養(yǎng)殖水體出現(xiàn)嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致水體中藻相失衡。浮游植物的群落組成變成藍(lán)藻成為優(yōu)勢(shì)種群。目前有毒藍(lán)藻引起的水華會(huì)引發(fā)很多問題。在養(yǎng)殖池塘中后期容易爆發(fā)有害藍(lán)藻水華，首先會(huì)破壞池塘藻相結(jié)構(gòu)，抑制有益藻類生存，破壞池塘的生態(tài)平衡。其次，藍(lán)藻門微囊藻屬的一些藻類大量繁殖會(huì)產(chǎn)生毒素。長(zhǎng)期暴露于微囊藻毒素的環(huán)境中不僅使養(yǎng)殖的水產(chǎn)生物減產(chǎn)，而且會(huì)嚴(yán)重影響人類健康，容易導(dǎo)致肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等[4-5]。藍(lán)藻產(chǎn)生的某些次生代謝產(chǎn)物被魚蝦吸收到體內(nèi)積累，破壞口感，影響魚蝦的使用價(jià)值。

目前常用的幾種治理策略包括物理方法[6]、化學(xué)方法[7]和生物方法[8]來調(diào)控池塘藻相。常用的物理方法有更換池塘中的水，保證水體干凈；多開增氧機(jī)來增加水體的流動(dòng)；也可潑灑一些試劑使藻類絮凝；或者直接人工將水體的藻類打撈出來。物理方法工作量大，成本高。化學(xué)方法主要是使用殺藻劑如硫酸銅、漂白粉、石灰等，近些年也有一些綜合性的除藻劑被使用?；瘜W(xué)方法見效快，成本低，但往往會(huì)給水體帶來新的污染。生物方法主要有放養(yǎng)一些以藍(lán)藻為食的濾食性魚類[9]；向水體投放復(fù)合微生物來降解水體中的污染物。生物方法常常局限性比較大，而且部分生物會(huì)帶來生物入侵?？傊酱业揭环N綠色、高效的藻華治理方法。

緩解藍(lán)藻水華的另一種方法是基于化感作用在靜水或富營(yíng)養(yǎng)化水體中使用植物作為殺藻劑。化感作用是植物或者微生物產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)并釋放出，對(duì)其他生物產(chǎn)生直接或間接的影響。蘆葦[10]、鳳眼蓮[11]、穗花狐尾藻[12]等水生植物，稻草[13]、大麥秸稈[14]等陸生植物對(duì)緩解有害藻華藻種有一定效果。我們前期比較馬齒莧（Portulaca oleracea）、吊蘭（Chlorophytum comosum）、野菊花（Chrysanthemum indicum）、長(zhǎng)壽花（Kalanchoe blossfeldiana）、蘆薈（Aloe vera）和綠蘿（Epipremnum aureum）6種常見陸地植物的抑藻效果，發(fā)現(xiàn)野菊花對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用最強(qiáng)。為了進(jìn)一步探討野菊花抑藻的活性成分，本實(shí)驗(yàn)比較不同浸提時(shí)間對(duì)野菊花抑制銅綠微囊藻效果的影響，為下一步應(yīng)用野菊花控制藍(lán)藻水華提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)材料：一株中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)分離出的純培養(yǎng)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ，F(xiàn)ACHB-905）。使用的野菊花花蕾產(chǎn)自大別山。

實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平（500 g/0.01 g），高速離心機(jī)（TG16-WS），生物顯微鏡（MoticBA210），恒溫光照培養(yǎng)箱（MGC-800BP-2）。

1.2 野菊花水浸提液制備

使用天平稱取5份20.00 g的野菊花，加到250 mL的錐形瓶中，然后分別向錐形瓶中加入125 mL蒸餾水，輕輕搖動(dòng)，使所有野菊花花蕾浸入到蒸餾水中，制備成濃度為160.00 g/L的母液。設(shè)置的浸提時(shí)間分別為2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。室內(nèi)自然水溫（16℃）浸提到指定時(shí)間后，8000 r/min離心10 min后收集菊花母液，放入帶蓋玻璃管中，-20℃低溫保存。

1.3 控藻實(shí)驗(yàn)

將處于指數(shù)增長(zhǎng)期的藻種接種到新配置的無(wú)菌BG11培養(yǎng)液中，保證初始藻的光密度OD650為0.03（細(xì)胞密度7.81×105cells/mL），分別加入不同浸提時(shí)間的野菊花母液5 mL（實(shí)驗(yàn)體系中野菊花濃度8 g/L），對(duì)照組加入5 mL的滅菌純水。為每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。將處理后裝有藻液的錐形瓶放在溫度25℃，光照強(qiáng)度是2000lx并且光暗比12:12的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天手動(dòng)搖動(dòng)三次，培養(yǎng)3d后取樣，將1 mL的樣品用魯哥氏液固定，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

使用浮游植物計(jì)數(shù)框（0.1 mL），在Motic BA210生物顯微鏡40倍下分別觀察記錄20個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，得到藻細(xì)胞密度（A），并根據(jù)以下公式計(jì)算銅綠微囊藻細(xì)胞日增長(zhǎng)率（μ）和抑制率（IR）[15]：μ(/d)=ln(A3/A0)/3，IR(%)=100×(μC-μT)/μC，其中，A3和A0是每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)束（day3）和開始（day0）時(shí)的細(xì)胞密度，μC和μT分別為對(duì)照和處理中銅綠微囊藻細(xì)胞日增長(zhǎng)率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

每個(gè)樣品中的藻細(xì)胞密度數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。使用Microsoft Excel 2010，統(tǒng)計(jì)3d后的藻細(xì)胞密度，計(jì)算其日增長(zhǎng)率，野菊花水浸提液的抑制率。用SPSS Statistics v22的單因素方差分析，分析不同浸提時(shí)間下得到的野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻的影響是否有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)變化

為探討野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻的影響，設(shè)置2 h、4 h、8 h、12 h和24 h的浸提時(shí)間浸提等量野菊花。暴露在不同浸提時(shí)間得到的野菊花水浸提液72 h后，經(jīng)過處理的銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)都顯著低于沒有經(jīng)過處理的組（p＜0.05）。并且銅綠微囊藻的細(xì)胞數(shù)隨著浸提時(shí)間增加而減幅越大，通過單因素方差分析的結(jié)果可以看出，2 h與4 h間差異不顯著但是與8 h、12 h、24 h有顯著性差異（p＜0.05）。而且經(jīng)過8h野菊花水浸提液處理的與12 h和24 h間沒有顯著性差異（p ＞0.05，圖1）。

2.2 基于銅綠微囊藻細(xì)胞日增長(zhǎng)率的抑制率

圖1 不同浸提時(shí)間野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)的影響Fig.1 Effects of water extract of C.indicum cell concentrations of M.aeruginosa under different extraction time.Different letters indicate significant differences among treatments(p＜0.05)

不同浸提時(shí)間野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的抑制率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，2 h的浸提處理，藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)率最大，為0.16/d，12 h，24 h處理時(shí)，比生長(zhǎng)率變成了負(fù)值，是-0.03/d，-0.05/d。浸提24 h有最高的抑制率為116.09%。

3 討論

表1 野菊花水浸提液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制率比較Table 1 Comparison of the growth inhibition rate of C.indicum water extracts on cell increase of M.aeruginosa

菊科是一種自然界里廣泛分布的植物，并且菊科植物化學(xué)成分的多樣性、復(fù)雜性遠(yuǎn)高于其他植物，其藥用功效的研發(fā)和應(yīng)用已有較大進(jìn)展[16]，在園林景觀等方面也有持久地發(fā)展[17]。前期已有研究發(fā)現(xiàn)菊科植物中有39個(gè)屬存在明顯的化感作用[18]。其中菊科植物中被明確鑒定出的能夠?qū)κ荏w植物起到抑制或促進(jìn)作用的化感物質(zhì)常是有機(jī)酸類、酚類、萜類等[1 9]。但是，菊科植物對(duì)有害藍(lán)藻影響方面的研究還較少，目前發(fā)現(xiàn)三種菊科植物[20-21]對(duì)銅綠微囊藻有一定的抑制效果。我們的前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)野菊花也有較強(qiáng)的抑藻效果，但仍不清楚其有效抑藻活性成分或物質(zhì)。本研究通過野菊花水浸提液抑藻實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分抑藻活性成分或物質(zhì)應(yīng)具有水溶性特征，這為我們下一步純化活性組分和分離活性物質(zhì)打下了基礎(chǔ)。

浸提時(shí)間的選擇影響到物質(zhì)的溶出程度和浸提效率。沈潔采用24 h對(duì)檉柳花（Tamarix chinensis Lour）進(jìn)行水浸提[22]。劉紅云選擇48 h對(duì)貓爪草（Ranunculi ternati）種子進(jìn)行水浸提并研究其對(duì)三種植物的影響[23]。慕小倩等人選擇72 h浸提得到10種菊科植物的水浸提液，研究其對(duì)小麥幼苗的化感作用[24]。但是不同浸提時(shí)間的比較研究卻很少。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)野菊花水浸提液最為有效的浸提時(shí)間為8h，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有報(bào)道中所采用的水浸提液浸提時(shí)間，將顯著提高浸提液制備效率，有助于后續(xù)對(duì)野菊花有效抑藻成分的純化和活性物質(zhì)的分離鑒定，也為其他植物源活性物質(zhì)的研發(fā)提供了方法上的參考。