槲皮素基于EGFR信號(hào)通路減輕大鼠氣道黏液高分泌①

鄔勛平 陶禹至 劉 琳 韓 婧 劉維佳 （貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支氣管哮喘和囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）等氣道炎癥性疾病進(jìn)展過(guò)程中的一個(gè)重要的病理生理特征，是影響COPD、支氣管哮喘及CF 病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-4］。越來(lái)越多的研究表明表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）在氣道黏液高分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中居于中心地位，當(dāng)EGFR被激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的黏液，導(dǎo)致氣道受阻［5］。目前治療氣道黏液高分泌的祛痰藥物眾多，大多為化學(xué)合成類(lèi)藥物，由于其毒副作用在臨床應(yīng)用上受到一定的限制，因此尋找毒副作用小，祛痰效果顯著的天然藥物成為研究重點(diǎn)之一。槲皮素作為一種植物天然來(lái)源的藥物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等生物學(xué)活性，但槲皮素是否能夠減輕氣道黏液高分泌及其分子調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。本研究通過(guò)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠氣道黏液高分泌模型，探討槲皮素對(duì)氣道黏液高分泌的作用以及對(duì)EGFR信號(hào)通路調(diào)控情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)過(guò)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審查批號(hào)：202019-010），選擇SPF 級(jí)6～8 周齡雄性SD 大鼠36 只，購(gòu)自遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心，體質(zhì)量（180±20）g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±1）℃，濕度45%～55%；自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑 槲皮素、LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；小鼠單克隆抗EGFR、p-EGFR、MUC5AC 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；小鼠單克隆PI3K抗體、兔多克隆抗PKC 抗體購(gòu)自武漢三鷹；兔多克隆抗NF-κB p65 抗體購(gòu)自北京博奧森公司；兔多克隆抗p-PI3K、p-PKC、AKT、p-AKT 抗體購(gòu)自上海艾比瑪特公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam；黏蛋白5AC（MUC5AC）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢云克??；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；HE 染色試劑盒、AB-PAS試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 氣道黏液高分泌大鼠模型的建立與分組將SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，對(duì)照組（Control）、脂多糖組（LPS）、槲皮素低劑量組（Que-L）、槲皮素中劑量組（Que-M）、槲皮素高劑量組（Que-H）、AG1478組；所有實(shí)驗(yàn)大鼠用4%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，在頸部環(huán)狀軟骨下方做皮膚切口，鈍性分離暴露氣管，LPS 組、Que-L 組、Que-M 組、Que-H 組、AG1478 組用2 mg/ml 的LPS 按3 mg/kg 氣管內(nèi)緩慢注入，Control 組用相同體積的0.9%氯化鈉氣管內(nèi)注入。氣管給藥前1 h Que-L、Que-M、Que-H劑量組分別給予50、100、200 mg/kg槲皮素溶液灌胃，AG1478 組氣管給藥前30 min 于腹腔注射AG1478 20 mg/kg，Control 組和LPS 組氣管給藥前1 h 灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉，1次/d，連續(xù)4 d。

1.2.2 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化及肺組織炎癥積分 將大鼠用4%戊巴比妥腹腔麻醉后，暴露心臟，取右中肺組織于4%多聚甲醛進(jìn)行固定24 h，干燥脫水，石蠟包埋后切成3 μm 厚的組織切片。HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化。參照文獻(xiàn)

［6］采用雙盲法，根據(jù)炎癥浸潤(rùn)累及的支氣管細(xì)支氣管數(shù)量和浸潤(rùn)程度、支氣管細(xì)支氣管管腔滲出的程度、炎癥浸潤(rùn)的血管數(shù)量以及肺實(shí)質(zhì)炎癥的程度等5 個(gè)方面（積分：0～26 分）對(duì)肺組織病理學(xué)改變進(jìn)行評(píng)定，計(jì)算肺組織炎癥積分。

1.2.3 AB-PAS 染色檢測(cè)杯狀細(xì)胞的增生和黏液的分泌 將3μm厚的肺組織切片常規(guī)脫蠟至水，阿利新蘭染液浸染15 min，水洗3 次，氧化劑氧化8 min，Schiff Reagent 浸染20 min。常規(guī)脫水、透明、封片。利用Image Pro Plus 圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)每組的陽(yáng)性著色面積。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)肺組織MUC5AC 含量 稱(chēng)取肺組織30 mg，剪碎，加入1 ml 裂解液，在冰上裂解10 min，10 000 g、4 ℃離心5 min，取上清待用。加樣：分別設(shè)空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔，待測(cè)樣品孔。依次加入100 μl 樣品，37 ℃孵育1 h；甩干，加檢測(cè)溶液A 100 μl，37 ℃孵育1 h；洗板3 次，加待測(cè)溶液B 100 μl，37 ℃孵育30 min；洗板5 次，加TMB 底物90 μl，37 ℃孵育15 min；加終止液50 μl，立即于450 nm處讀數(shù)。

1.2.5 IHC檢查MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB的表達(dá) 取3μm 厚的肺組織切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，高壓修復(fù)10 min，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min，山羊血清封閉2 h，MUC5AC（1∶200）、EGFR（1∶200）、PKC（1∶100）、NF-κB（1∶100）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶200）37 ℃孵育2 h，DAB 顯色，蘇木素染核2 min，自來(lái)水洗返藍(lán)15 min，常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片。在光鏡下觀察陽(yáng)性染色呈棕黃色，利用Image Pro Plus 圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)每組的平均光密度值。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)肺組織MUC5AC、EGFR mRNA 表達(dá) 使用Trizol 提取總RNA，RNA/DNA 紫外可見(jiàn)光度法檢測(cè)總RNA 的濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按擴(kuò)增試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增。通過(guò)GAPDH 校正并使用公式x=2-ΔΔCt計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)的基因引物序列Tab.1 Sequence of gene primers for real-time quantita?tive PCR detection

1.2.7 Western blot 檢測(cè)EGFR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 稱(chēng)取肺組織30 mg，剪碎，加入250 μl RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min 取上清凍存于-80 ℃待用，利用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將各組蛋白取20 μg 上樣后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。按照所測(cè)蛋白的分子量裁剪PVDF膜，然后分別孵育相應(yīng)抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶20 000）及山羊抗小鼠二抗（1∶10 000），冰上孵育2 h，洗膜，顯影。使用圖像分析軟件Image J 測(cè)定目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度值（OD 值），以目的條帶OD 值比內(nèi)參條帶的OD值表示目的蛋白的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS22.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠情況 在開(kāi)始建模前所有大鼠精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量增長(zhǎng)均勻，食欲好，無(wú)任何顯著性差異。大鼠氣管注入LPS后精神狀態(tài)差，活動(dòng)少，呼吸急促，食欲下降，體質(zhì)量減輕。AG1478 及槲皮素Que-L、Que-M、Que-H 劑量組干預(yù)后上述癥狀逐漸減輕。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)檢查 HE 染色在光鏡下觀察對(duì)照組支氣管上皮結(jié)構(gòu)清晰，周?chē)匆?jiàn)或偶見(jiàn)炎癥細(xì)胞；LPS組支氣管上皮增厚，杯狀細(xì)胞及黏膜下腺體增生肥大，支氣管管壁和周?chē)谓M織有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔發(fā)生不完全阻塞，肺組織炎癥積分顯著升高（P<0.05）；Que-L、Que-M、Que-H劑量組以及AG1478 干預(yù)后上述病理癥狀改變減輕，肺組織炎癥積分逐漸下降（P<0.05，圖1、表2）。

表2 肺組織炎癥積分（±s，n=6）Tab.2 Lung inflammation score（±s，n=6）

表2 肺組織炎癥積分（±s，n=6）Tab.2 Lung inflammation score（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with Que-L group，3）P<0.05；com?pared with Que-M group，4）P<0.05.

Score 2.11±0.83 12.17±2.201）10.22±2.501）8.28±2.121）2）5.00±1.251）2）3）4）3.78±1.062）3）4）Groups Control LPS Que-L Que-M Que-H AG1478

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（×400）Fig.1 Pathological changes of rat lung tissue in each group（×400）

2.3 各組大鼠肺組織杯狀細(xì)胞增生和黏液的分泌情況 AB-PAS 染色在光鏡下觀察到大鼠氣道上皮的杯狀細(xì)胞增生以及一些黏液物質(zhì)被染成藍(lán)色，陽(yáng)性染色主要見(jiàn)于氣管、支氣管黏膜上皮、管腔和黏膜下腺體。與Control 組相比，LPS 組可見(jiàn)支氣管氣道上皮大量藍(lán)色杯狀細(xì)胞增生，陽(yáng)性著色面積顯著增大，而Que-L、Que-M、Que-H 劑量組干預(yù)后，杯狀細(xì)胞增生逐漸減少，陽(yáng)性染色面積也相應(yīng)減少（P<0.05，圖2、表3）。

表3 AB-PAS陽(yáng)性著色面積百分比（±s，n=6）Tab.3 AB-PAS staining percentage（±s，n=6）

表3 AB-PAS陽(yáng)性著色面積百分比（±s，n=6）Tab.3 AB-PAS staining percentage（±s，n=6）

Note：AB-PAS staining percentage. Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with Que-L group，3）P<0.05；compared with Que-M group，4）P<0.05.

Percentage/%4.38±1.20 26.11±8.101）24.46±6.321）18.18±4.421）2）10.60±1.942）3）4）8.54±2.622）3）4）Groups Control LPS Que-L Que-M Que-H AG1478

圖2 各組大鼠肺組織黏液分泌情況（×400）Fig.2 Mucus secretion in lung tissue of rats in each group（×400）

2.4 不同濃度的槲皮素對(duì)大鼠肺組織中MUC5AC的影響 IHC結(jié)果顯示MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB的陽(yáng)染顆粒主要見(jiàn)于氣道上皮，部分在黏膜下腺體；與對(duì)照組相比，LPS 組MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB 表達(dá)顯著增多，Que-L、Que-M、Que-H 劑量組干預(yù)后，上述蛋白表達(dá)逐漸減少（P<0.05）；ELISA檢測(cè)MUC5AC 的表達(dá)與免疫組化結(jié)果一致，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖3、表4）。

圖3 各組大鼠肺組織中MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB的表達(dá)（×200）Fig.3 Expressions of MUC5AC，EGFR，PKC and NF-κB in lung tissues of rats in each group（×200）

表4 各組大鼠MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB的表達(dá)（±s，n=6）Tab.4 Expressions of MUC5AC，EGFR，PKC and NF-κB in rats（±s，n=6）

表4 各組大鼠MUC5AC、EGFR、PKC、NF-κB的表達(dá)（±s，n=6）Tab.4 Expressions of MUC5AC，EGFR，PKC and NF-κB in rats（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with Que-L group，3）P<0.05；compared with Que-M group，4）P<0.05.

MUC5AC/（pg·ml-1）367.1±71.93 826.3±69.461）742.0±45.671）608.8±94.241）2）368.9±64.512）3）4）319.8±55.682）3）4）Groups Control LPS Que-L Que-M Que-H AG1478 MUC5AC 0.56±0.11 2.30±0.801）1.65±0.131）1.32±0.072）0.41±0.152）3）0.38±0.062）3）4）EGFR 0.40±0.01 5.03±0.551）3.87±0.451）2）3.54±0.611）2）1.13±0.262）3）4）0.32±0.082）3）4）PKC 0.70±0.13 2.61±0.361）2.16±0.191）1.85±0.081）1.26±0.382）3）1.30±0.372）3）NF-κB 1.32±0.21 7.50±1.661）4.65±0.771）2）3.94±0.441）2）2.79±0.182）2.40±0.652）

2.5 各組大鼠肺組織中MUC5AC、EGFR 的mRNA表達(dá)水平 與Control 組相比，LPS 組MUC5AC 及EGFR 的mRNA 水平顯著升高（P<0.05）；與LPS 組相比，Que-L、Que-M、Que-H 劑量組干預(yù)后MUC5AC及EGFR 的mRNA 水平逐漸降低；Que-H 劑量組和陽(yáng)性對(duì)照AG1478 組能顯著降低MUC5AC 及EGFR的mRNA水平（P<0.05，表5）。

表5 肺組織MUC5AC、EGFR mRNA水平（±s，n=6）Tab.5 MUC5AC，EGFR mRNA levels in lung tissue（±s，n=6）

表5 肺組織MUC5AC、EGFR mRNA水平（±s，n=6）Tab.5 MUC5AC，EGFR mRNA levels in lung tissue（±s，n=6）

Note：RT-qPCR. Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with Que-L group，3）P<0.05；compared with Que-M group，4）P<0.05.

EGFR mRNA 1.00±0.33 3.82±0.081）2.88±0.251）2）1.76±0.071）2）3）1.29±0.022）3）1.30±0.182）3）Groups Control LPS Que-L Que-M Que-H AG1478 MUC5AC mRNA 1.00±0.21 4.42±0.451）3.16±0.151）2）2.42±0.311）2）1.26±0.272）3）4）1.30±0.182）3）4）

2.6 EGFR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺組織中的表達(dá)情況與Control 組相比，LPS 組p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-PKC/PKC、p-AKT/AKT、NF-κB 的表達(dá)顯著增多（P<0.05），與LPS 組相比，槲皮素高劑量組和AG1478 組能夠顯著下調(diào)EGFR、PI3K、PKC、AKT 的磷酸化水平，抑制NF-κB表達(dá)（P<0.05，表6，圖5）。

表6 不同濃度槲皮素對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響（±s，n=6）Tab.6 Effects of different doses of quercetin on EGFR signaling pathway（±s，n=6）

表6 不同濃度槲皮素對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響（±s，n=6）Tab.6 Effects of different doses of quercetin on EGFR signaling pathway（±s，n=6）

Note：Western blot.Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with Que-L group，3）P<0.05；compared with Que-M group，4）P<0.05.

NF-κB 1.00±0.01 1.64±0.181）1.56±0.171）1.29±0.15 1.03±0.212）3）1.08±0.082）3）Groups Control LPS Que-L Que-M Que-H AG1478 p-EGFR/EGFR 1.00±0.02 2.07±0.091）1.97±0.121）1.55±0.071）2）3）1.15±0.142）3）4）0.94±0.172）3）4）p-PI3K/PI3K 1.00±0.010 1.30±0.111）1.17±0.10 1.09±0.082）0.99±0.142）0.87±0.112）3）p-PKC/PKC 1.00±0.00 1.76±0.121）1.74±0.221）1.28±0.102）3）1.24±0.022）3）1.05±0.062）3）p-AKT/AKT 1.00±0.07 1.38±0.131）1.35±0.151）1.11±0.19 0.72±0.092）3）4 0.69±0.082）3）4

3 討論

氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥疾病主要的臨床表現(xiàn)和病理特征之一，出現(xiàn)氣道黏液高分泌癥狀的慢性氣道炎癥性疾病患者具有較差的肺功能，因此出現(xiàn)高住院率與病死率［7］。在正常生理?xiàng)l件下，氣道黏液物質(zhì)作為呼吸系統(tǒng)固有免疫的重要組成部分，可黏附吸入的顆粒物，通過(guò)纖毛清除運(yùn)動(dòng)運(yùn)輸至體外，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用；但在吸煙、細(xì)菌以及病毒等多種致病因素作用下，黏液分泌過(guò)多，氣道纖毛清除功能下降導(dǎo)致黏液清除率下降，可加重細(xì)菌定植，出現(xiàn)慢性肺部感染與急性加重。因此明確氣道黏液高分泌與氣道炎癥性疾病之間的關(guān)系，深入探究氣道黏液高分泌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于氣道黏液高分泌的祛痰治療具有重要作用。

LPS 作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，當(dāng)進(jìn)入氣道時(shí)會(huì)誘發(fā)氣道炎癥，從而產(chǎn)生過(guò)多的黏液，常被用來(lái)誘導(dǎo)一些氣道炎癥和黏液分泌過(guò)多［8-9］。MUC5AC 是黏液中最主要的蛋白之一，主要由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，MUC5AC mRNA 或MUC5AC 可作為氣道杯狀細(xì)胞增生、化生的標(biāo)志，氣道分泌物中MUC5AC 的含量和氣道上皮MUC5AC 的轉(zhuǎn)錄水平可反映氣道黏液產(chǎn)生分泌的強(qiáng)度。本研究以SD 大鼠為研究對(duì)象，向氣管中滴注LPS，以肺組織病理學(xué)、肺組織炎癥積分、黏液分泌3個(gè)參數(shù)建立氣道黏液高分泌大鼠模型。與對(duì)照組相比，LPS 組大鼠氣道上皮增厚，杯狀細(xì)胞及黏膜下腺體增生肥大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔發(fā)生不完全性阻塞，肺炎癥積分和AB-PAS 黏液陽(yáng)性著色面積也明顯增加，并且MUC5AC 的表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明，LPS 氣管內(nèi)注入能成功誘導(dǎo)大鼠氣道黏液高分泌。

近年來(lái)，植物來(lái)源的藥物越來(lái)越受重視，在臨床上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。槲皮素是一種多羥基黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)，由于含有許多酚類(lèi)羥基，具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化性能，現(xiàn)研究已證實(shí)槲皮素是最有前途的用于預(yù)防和治療炎癥相關(guān)性的慢性疾病的天然藥物之一［10-11］。在肺部疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能顯著改善肺部炎癥和黏液分泌過(guò)多［12-13］。本研究結(jié)果表明槲皮素能以劑量依賴性方式顯著降低LPS 誘導(dǎo)的炎癥損傷；在槲皮素干預(yù)后，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道上皮增厚的病理變化得到改善，杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌減少，肺組織炎癥積分以及AB-PAS 陽(yáng)性著色面積降低；并進(jìn)一步分析了肺組織中MUC5AC 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠明顯抑制MUC5AC 的表達(dá)。提示槲皮素對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠氣道黏液高分泌具有保護(hù)作用，而其機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

EGFR 屬于ErbB 受體家族的一種，屬于酪氨酸激酶型受體，位于細(xì)胞膜表面，在氣道黏液高分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中居于中心地位，多種刺激因素均可通過(guò)活化EGFR 及其下游通路誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和化生，導(dǎo)致過(guò)量黏蛋白的合成，引起氣道炎癥［14］；如吸煙會(huì)誘導(dǎo)大量的活性氧和蛋白酶的產(chǎn)生從而引起EGFR 磷酸化進(jìn)而激活其下游信號(hào)通路，而EGFR 酪氨酸激酶抑制劑AG1478 則可抑制EGFR活化所引起的杯狀細(xì)胞增生和MUC5AC 的表達(dá)增多［15-16］?，F(xiàn)研究較明確EGFR下游通路之一是PI3K/PKC/AKT/NF-κB 信號(hào)通路。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過(guò)抑制EGFR/NF-κB 的磷酸化從而減少由香煙所誘導(dǎo)的黏液高分泌［13］，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素等天然黃酮或異黃酮化合物還是EGFR 小分子抑制劑［17-18］。為了進(jìn)一步明確槲皮素對(duì)氣道黏液高分泌作用的機(jī)制，本研究采用AG1478 作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，槲皮素進(jìn)行干預(yù)，對(duì)EGFR 通路相關(guān)蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予槲皮素干預(yù)后EGFR 及MUC5AC的mRNA 水平和EGFR 蛋白磷酸化水平劑量依賴性降低，其下游分子PI3K、PKC、AKT 蛋白磷酸化水平也相應(yīng)劑量依賴性降低，NF-κB 蛋白表達(dá)劑量依賴性減少。給予AG1478 后，EGFR 及MUC5AC 的mRNA 水平顯著降低，EGFR 及其相應(yīng)下游蛋白磷酸化水平降低，NF-κB 蛋白表達(dá)下調(diào)。提示槲皮素可能通過(guò)抑制EGFR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，下調(diào)MUC5AC的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的。

綜上所述，槲皮素具有強(qiáng)大的抗炎作用，對(duì)氣道黏液高分泌治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其發(fā)揮作用的途徑可能與調(diào)節(jié)EGFR/PI3K/PKC/AKT/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。但是槲皮素由于其水溶性差在臨床上的應(yīng)用受限，并且其生物學(xué)功能多，在體內(nèi)發(fā)揮功能的信號(hào)通路比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步明確其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制并選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)分子才能為精準(zhǔn)治療氣道黏液高分泌提供指導(dǎo)。