活血益氣方促缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及其相關(guān)調(diào)控基因mRNA表達(dá)的拆方研究

活血益氣方是基于冠心病氣虛血瘀病機(jī)構(gòu)建的臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本方可激活血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，促進(jìn)心肌梗死后血管新生，增加心肌側(cè)支循環(huán)的建立，具有提高后心力衰竭心臟功能和逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)改善心肌缺血的作用[1-4]。從細(xì)胞機(jī)制來講，血管內(nèi)皮細(xì)胞是缺血性心臟病中血管新生的主要靶細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及其與基底膜解離并穿過血管壁移行到血管周圍間隙，進(jìn)而黏附、芽生，形成管腔結(jié)構(gòu)等一系列過程是血管新生的關(guān)鍵步驟[5]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)是研究血管生成的主要細(xì)胞，通過檢測HUVEC的增殖及遷移能力可用于評估血管生成的能力。前期研究表明，活血益氣方及其拆方可明顯促進(jìn)缺氧后HUVEC的增殖并抑制其凋亡，作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PKC/Ras/ Raf-1信號通路和減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[6]。然而，活血益氣方及其拆方對內(nèi)皮細(xì)胞增殖之后其他重要環(huán)節(jié)的調(diào)控作用尚未可知。為進(jìn)一步明確活血益氣方及其拆方促血管新生的細(xì)胞機(jī)制及配伍規(guī)律，本研究通過建立HUVEC缺氧模型模擬心肌缺血缺氧的病理環(huán)境，觀察活血益氣方及其拆方藥物血清對缺氧HUVEC遷移能力的影響，并通過研究其對細(xì)胞遷移粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和應(yīng)激活化蛋白激酶-2(mitogen-activated protein kinases-2，p38)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的作用，進(jìn)一步探索活血益氣方促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Scien Cell研究實(shí)驗(yàn)室，批號：15482)。成年健康雄性SD大鼠32只，7周齡，體重230～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級屏障動物房，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物及試劑 活血益氣方：黃芪60 g，黨參60 g，丹參10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g；活血方：丹參10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g；益氣方：黃芪60 g，黨參60 g。所有藥物均采用免煎顆粒，由北京康仁堂醫(yī)藥有限公司提供，常溫干燥保存。ECM培養(yǎng)基、胰酶/EDTA消化液、胰酶中和液、牛源纖維粘連蛋白(Scien Cell研究實(shí)驗(yàn)室，批號分別為21430，18898，18952，17573)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛、1%結(jié)晶紫染色液(Solarbio科技有限公司，批號分別為20170221，20160425，20160811)；Trizol試劑(Ambion公司，批號101004)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific，批號00337818)；SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems，批號1610048)；Transwell Insert (Merck-millipore，批號M151315)。

1.3 主要儀器 EQR/GL-41A超凈工作臺(ESCO公司)，IMT-2倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，MCO-20AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司)，MiniGalaxy A三氣培養(yǎng)箱(RS biotech公司)，GeneAmp PCR system 9700基因擴(kuò)增儀(美國AB 公司)，Mx3000P實(shí)時熒光定量PCR儀(美國安捷倫科技公司)，Gene Quant紫外分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech公司)。

1.4 藥物血清制備 將32只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、活血益氣方組、活血方組和益氣方組，每組8只。參照文獻(xiàn)[2]，按照活血益氣方組16.086 g/(kg·d)，活血方組4.016 4 g/(kg·d)，益氣方組12.049 2 g/(kg·d)的劑量，5 mL/kg體重給予大鼠相應(yīng)藥物灌胃，正常對照組灌服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。采血前12 h禁食不禁水，末次給藥后1 h，將大鼠按5 mL/kg體重腹腔注射7%水合氯醛進(jìn)行麻醉。待大鼠完全麻醉后，備皮，無菌腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，合并同組血清，56 ℃滅活30 min，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HUVEC缺氧模型的建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[6]，取對數(shù)生長期的HUVEC均勻接種于纖維粘連蛋白(2 μg/cm2)預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，換用含0.5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。繼續(xù)換用完全ECM培養(yǎng)基(5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物)，將細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養(yǎng)24 h，建立缺氧HUVEC細(xì)胞模型，另設(shè)相應(yīng)的正常對照組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將缺氧HUVEC分為缺氧組、活血益氣方組、活血方組、益氣方組。藥物組分別換用含活血益氣方、活血方、益氣方藥物血清的ECM培養(yǎng)基(10%相應(yīng)藥物血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物)，正常對照組和缺氧組換用含10%正常對照血清的ECM培養(yǎng)基干預(yù)24 h。

1.6 Transwell Insert檢測細(xì)胞遷移 建立細(xì)胞缺氧模型后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，采用基礎(chǔ)ECM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。將Transwell Insert置于24孔板中，下層小室中加入600 μL含10%相應(yīng)藥物血清的ECM培養(yǎng)基，將細(xì)胞按1×105個/孔均勻加入上層小室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出上層小室，用棉簽輕拭去小室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡下觀察微孔濾膜下表面的細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，每個樣本隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野(×200)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞FAK、p38、MAP激酶活化蛋白激酶(MAPKAPK)、熱休克蛋白27(HSP27)mRNA表達(dá) 將細(xì)胞按1×105/孔均勻接種于6孔板中，建立細(xì)胞缺氧模型，藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞。采用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定吸光度A260/A280，計(jì)算其濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，每組設(shè)5個復(fù)孔。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、1 min，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、20 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。目的基因引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成，目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 活血益氣方及其拆方對缺氧HUVEC遷移的影響 與正常對照組比較，缺氧組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少(P<0.01)。與缺氧組比較，活血益氣方組、活血方組及益氣方組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著增加(P<0.05或P<0.01)?；钛鏆夥浇M細(xì)胞遷移數(shù)高于活血方組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；益氣活血方組高于益氣方組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

組別只數(shù) 細(xì)胞遷移數(shù)正常對照組3236.867±5.015缺氧組3118.333±5.0991)活血益氣方組3149.733±3.5801)3)活血方組3133.400±3.3001)2)4)益氣方組3143.867±5.4971)3)

與正常對照組比較，1)P<0.01；與缺氧組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與活血益氣方組比較，4)P<0.05

2.2 活血益氣方及其拆方對FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表達(dá)的影響 與正常對照組比較，缺氧組細(xì)胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)。與缺氧組比較，活血益氣方組、活血方組、益氣方組細(xì)胞FAK、p38 mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05或P<0.01)；活血益氣方組、益氣方組細(xì)胞MAPKAPK mRNA表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，活血方組細(xì)胞MAPKAPKmRNA表達(dá)上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；活血益氣方組HSP27 mRNA表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，活血方組、益氣方組HSP27 mRNA表達(dá)水平上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

3 討 論

活血益氣方由黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍、紅花等藥物組成，方中黃芪、黨參相須相使，達(dá)補(bǔ)氣培元的功效，使五臟得養(yǎng)，心氣得充，配以丹參、川芎等藥物活血養(yǎng)血，則心氣得以血?dú)庵︷B(yǎng)，可理氣活血、化瘀止痛，在臨床應(yīng)用中得到顯著療效。此外，大量基礎(chǔ)研究表明，活血益氣方可顯著增加大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度，促進(jìn)血管新生[1-4]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞透過血管壁發(fā)生遷移是新血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞移行至血管周圍間隙時，可通過進(jìn)一步的黏附與增殖形成血管芽，再經(jīng)過周圍細(xì)胞的包繞逐漸形成新的血管。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧后HUVEC遷移能力顯著受到抑制，活血益氣方及其拆方可明顯改善缺氧對HUVEC遷移的損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)活血益氣方及其拆方還可促進(jìn)缺氧HUVEC增殖并抑制其凋亡[6]，顯示出活血益氣方顯著的促血管新生效用，并提示其作用機(jī)制可能與靶向內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控相關(guān)信號通路促進(jìn)缺氧后內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移并減少其凋亡有關(guān)。多項(xiàng)研究表明，活血益氣方中的主藥黃芪、丹參、川芎、赤芍以及丹參配伍黃芪、川芎配伍黃芪等。對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力均具有明顯促進(jìn)作用[7-9]。

A、B、C分別為正常對照組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；D、E、F分別為缺氧組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；G、H、I分別為活血益氣方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；J、K、L分別為活血方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；M、N、O分別為益氣方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野

圖1各組HUVEC遷移情況

表3 各組對缺氧HUVEC FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表達(dá)水平的影響(±s)

與正常對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與缺氧組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

細(xì)胞遷移是一種動態(tài)的、多步驟的生理病理過程，包括細(xì)胞前緣突出，與細(xì)胞外基質(zhì)形成粘著斑，局灶性粘連的周轉(zhuǎn)，繼而產(chǎn)生牽引力等[10]。FAK是一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，可加強(qiáng)局灶性粘連周轉(zhuǎn)過程。在VEGF介導(dǎo)的信號通路中，活化的FAK與Src家族激酶形成復(fù)合物，通過磷酸化其他蛋白質(zhì)啟動多個下游信號傳導(dǎo)途徑，以介導(dǎo)各種細(xì)胞的遷移[11]，是細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞存活的正向調(diào)節(jié)因子[12-13]。FAK是VEGFR-2和整合素αvβ3之間的融合信號點(diǎn)，它控制了在內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程中調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合所必需的局灶性粘連的組裝/拆卸[14]。FAK基因敲除小鼠引起胚胎早期致死性與廣泛的心血管缺陷[15]。

此外，p38-MAPK信號通路是VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的另一重要靶向途徑。VEGF可通過刺激p38，進(jìn)而導(dǎo)致MAP激酶活化蛋白激酶-2/3(mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2/3，MAPKAPK-2/3)和絲狀肌動蛋白聚合調(diào)節(jié)分子及HSP27的激活，將VEGF信號傳遞到微絲，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排，最終產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞移行[16]。FAK介導(dǎo)的局灶性粘連周轉(zhuǎn)以及p38介導(dǎo)的肌動蛋白聚合在促進(jìn)形成應(yīng)激纖維中具有互補(bǔ)作用，這些結(jié)構(gòu)產(chǎn)生牽引細(xì)胞所需的收縮力，從而使內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，活血益氣方及其拆方可不同程度地上調(diào)缺氧抑制的FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA的表達(dá)水平，提示活血益氣方及其拆方可改善缺氧導(dǎo)致的FAK及p38-MAPK信號通路活性的降低，促進(jìn)細(xì)胞骨架重組，提高HUVEC的移行能力進(jìn)而發(fā)揮促血管新生效應(yīng)。其中活血益氣方促遷移效應(yīng)最強(qiáng)，益氣方優(yōu)于活血方，提示在促進(jìn)遷移的作用方面活血方和益氣方協(xié)同配伍，而益氣藥物發(fā)揮主要作用。前期試驗(yàn)表明，活血益氣方可以促進(jìn)HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(參與降解細(xì)胞外基質(zhì))[17]、一氧化氮(nitric oxide，NO)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS，參與VEGF介導(dǎo)的血管滲透性增加)[17]的產(chǎn)生，提示活血益氣方能增加細(xì)胞外基質(zhì)成分和基底膜的降解，通過促進(jìn)eNOS分泌催化生成NO或直接促進(jìn)NO的分泌，提高血管通透性，為內(nèi)皮細(xì)胞向血管周圍間隙移行提供有利環(huán)境，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，活血益氣方及其拆方可提高缺氧后HUVEC的遷移能力，這一作用可能是通過調(diào)節(jié)FAK及p38-MAPK信號通路來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，推測活血益氣方及其拆方可對血管新生中細(xì)胞機(jī)制的多個環(huán)節(jié)進(jìn)行多靶點(diǎn)的調(diào)控，這是其促進(jìn)缺血心肌血管新生，改善缺血性心臟病的關(guān)鍵途徑之一。