枇杷葉不同成分抗氧化和止咳祛痰活性研究

黃素華 陳彤 邱豐艷 洪燕萍

摘要：采用分光光度法測(cè)定枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]葉提取物中的黃酮、多酚、總萜及其含量;采用DPPH和FRAP法檢測(cè)其抗氧化活性;采用氨水引咳法和氣管酚紅排泌法研究其止咳祛痰活性，并分析其成分與抗氧化、止咳祛痰活性的相關(guān)性。結(jié)果表明，6種枇杷葉提取物均具有抗氧化活性，其中黃酮抗氧化活性顯著高于三萜酸，多糖抗氧化活性較差，提取物的抗氧化活性與黃酮和多酚含量顯著相關(guān);6種提取物均具有止咳祛痰活性，黃酮和三萜酸的效果相近，多糖較差，成分含量與活性相關(guān)性分析顯示，黃酮能減少咳嗽次數(shù)，總萜能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，且有一定的祛痰作用。枇杷葉中黃酮、多酚可能是抗氧化的重要成分，黃酮與止咳祛痰活性相關(guān)，通過精制富集有效成分，能提高相關(guān)活性。

關(guān)鍵詞：枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]葉提取物;抗氧化;止咳祛痰;黃酮;多酚;總萜;相性

中圖分類號(hào)：S667.3? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）12-0138-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.032? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Determination of flavonoid， polyphenol， total terpene and their contents in loquat[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.] leaf extracts by spectrophotometry， DPPH and FRAP method were used to determine the antioxidant activity， cough model induced by ammonia liquor in mice to observe the antitussive effects，the method of phenol red execretion in mice was used to investigate expectorant effects，and the correlation of composition and the activity were analyzed. Results showed that the loquat leaf extracts had certain antioxidant activity， the flavonoids were significant better than triterpenoid acid， the polysaccharides were weaker， and the antioxidant activity related to the content of flavonoids and total polyphenols. All the 6 kinds of loquat leaf extract had certain antitussis and expectorant activity， the flavonoids and triterpenoid acid were better than the polysaccharides， the times of cough and the content of flavonoid showed significantly negative correlation， the saponins had certain dosage-effect relation with prolonged the incubation period of cough and expectorable activity. The extracts of loquat leaf had antioxidation and antitussis and expectorant activity， flavonoids and polyphenols could be important part of the antioxidant component， flavonoids and saponins were associated with antitussis and expectorant activity. Through the refined， the effective components can be enriched and the relevant activity can be improved.

Key words： extract of loquat [Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.] leaves; antioxidant activity; antitussive and expectorant activity; flavonoids; polyphenol; total terpene; correlation

枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]屬于薔薇科植物，在中國(guó)有2 200多年的栽培歷史[1]。其藥用價(jià)值始載于《名醫(yī)別錄》，是常見的中藥材。枇杷葉中的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，主要有三萜酸類、倍半萜類、多酚類、黃酮類以及糖苷類化合物[2]。三萜酸類成分因其功效顯著而備受重視，許多研究表明枇杷葉三萜酸具有抗炎、鎮(zhèn)咳、抗癌、調(diào)節(jié)血糖、抗抑郁、保肝護(hù)肝等作用[3，4]。枇杷葉黃酮類成分具有抗氧化、抗炎、抗癌、保肝護(hù)肝等功能[5，6]。何玉琴[7]研究了枇杷葉黃酮提取物的功效，結(jié)果顯示提取物對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）感染的雛雞肝功能及腎功能有顯著保護(hù)作用，能提高IBV抗體水平，同時(shí)能提高雛雞的生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)。枇杷葉多糖在抗氧化[5，8]和抗疲勞上有一定功效[9]。枇杷葉提取物具有很好的抗氧化和止咳作用[10]，但具體是哪類成分起主要作用并不確定。本研究以6種純化前、后的枇杷葉提取物黃酮、三萜酸、多糖為材料，研究其止咳祛痰和抗氧化活性及其活性與黃酮、總酚、皂苷含量的相關(guān)性，為枇杷葉的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

6種提取物：精制黃酮、粗黃酮、精制三萜酸、粗三萜酸、精制多糖、粗多糖。

枇杷葉經(jīng)醇提濃縮，去醇加水，獲沉淀及上清液兩部分，分別富含三萜酸和黃酮，稱粗三萜酸和粗黃酮，并經(jīng)不同純化過程得到精制三萜酸和精制黃酮[11]。醇提后枇杷葉濾渣，經(jīng)水提醇沉得到粗多糖，經(jīng)大孔樹脂純化得到精制多糖[5]。

1.2? 方法

1.2.1? 含量測(cè)定? 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定黃酮含量;以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定總萜含量;以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-ciocalteu方法測(cè)定總酚含量[12]。

1.2.2? 枇杷葉提取物抗氧化活性測(cè)定

1）自由基清除能力的測(cè)定——DPPH法。6種提取物溶解稀釋成不同濃度，取稀釋液20 μL，加1.98 mL DPPH無水乙醇溶液反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的OD值，計(jì)算DPPH自由基清除率，以反應(yīng)體系中提取物含量（μg/g）為X軸，以自由基清除率為Y軸作圖，根據(jù)清除率線性回歸曲線計(jì)算EC50，EC50越低，自由基清除能力越大[12]。

2）總還原能力的測(cè)定——FRAP法。0.2 mL不同濃度FeSO4加1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反應(yīng)10 min，593 nm測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種枇杷葉提取物溶解稀釋成適當(dāng)濃度，取稀釋液0.2 mL加1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反應(yīng)10 min，測(cè)定593 nm處OD值。根據(jù)吸光度的大小計(jì)算樣品總還原能力[13]。

1.2.3? 枇杷葉提取物的止咳、化痰活性? 取清潔級(jí)雄性昆明小鼠120只，體重22±2 g，隨機(jī)分成8組，為陰性對(duì)照組（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（體積分?jǐn)?shù)為0.2%氯化銨）及枇杷葉提取物試驗(yàn)組，每組15個(gè)重復(fù)，采用氨水引咳法和氣管酚紅排泌法研究提取物的止咳和祛痰活性[10]。

氨水引咳法。枇杷葉提取物組（0.04 g/mL）灌胃劑量為0.05 mL/10 g小鼠，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組灌胃劑量為0.1 mL/10 g小鼠，每天分別灌胃，連續(xù)10 d，各組末次給藥1 h后，將小鼠置于倒扣的1 L燒杯內(nèi)。吸取體積分?jǐn)?shù)25%～28%氨水0.5 mL注入棉球上，再放入燒杯內(nèi)。觀察并記錄小鼠咳嗽的潛伏期及3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

氣管段酚紅排泌法。小鼠灌胃給藥與止咳試驗(yàn)一致，各組末次給藥1 h后，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.5%的酚紅0.5 mL（小鼠體重約35±2.6 g）。0.5 h后處死小鼠，剪下一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水的試管中，再加入1 mol/L NaOH 0.1 mL，避光放置30 min后，用紫外可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定OD值。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 6種枇杷葉提取物中黃酮、總酚、總萜含量及抗氧化活性

2.1.1? 6種枇杷葉提取物中黃酮、總酚、總萜含量及DPPH（EC50）、FRAP值? 由表1中FRAP值可知，6種枇杷葉提取物抗氧化活性強(qiáng)弱依次為精制黃酮>粗黃酮>粗三萜酸>精制三萜酸>粗多糖>精制多糖，黃酮提取物的抗氧化活性較三萜酸提取物高，多糖提取物抗氧化活性較差。樣品黃酮純化后黃酮、總酚、總萜含量均極顯著提高，F(xiàn)RAP值也極顯著提高，DPPH值降低，表明黃酮純化后成分含量升高，抗氧化能力提高;樣品三萜酸純化后總萜含量極顯著升高，總酚含量極顯著降低，F(xiàn)RAP值極顯著下降，表明三萜酸純化雜質(zhì)減少，抗氧化能力下降;樣品多糖純化后黃酮、總酚和總萜含量極顯著降低，F(xiàn)RAP值極顯著下降，DPPH值降低，表明多糖純化后黃酮多酚含量下降導(dǎo)致總還原能力下降，但清除自由基能力反而上升，可能多糖具有一定的自由基清除能力。

許多植物的藥用活性與其抗氧化活性密切相關(guān)[14]。黃酮、總酚是自然界存在的天然抗氧化成分，許多植物的抗氧化活性與黃酮、總酚含量有關(guān)[15，16]。枇杷葉中富含黃酮成分，抗氧化活性是最主要的生物活性，樣品黃酮純化后黃酮含量極顯著提高，因此抗氧化能力提高。三萜酸及多糖純化后，總酚含量減少，總還原能力下降。

2.1.2? 抗氧化能力與黃酮、總酚含量的相關(guān)關(guān)系? 通常認(rèn)為黃酮、總酚是較好的抗氧化物質(zhì)，因此在測(cè)定黃酮、總酚、總萜含量及DPPH自由基清除能力與FRAP法測(cè)定的總還原能力的基礎(chǔ)上，分別對(duì)黃酮含量、總酚含量、黃酮與總酚的總含量、總萜含量與DPPH自由基清除能力（EC50）及總還原能力（FRAP法）之間進(jìn)行線性回歸分析，判定它們之間是否存在相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，黃酮含量與FRAP值呈極顯著相關(guān)，多酚含量與FRAP值呈顯著相關(guān)，說明枇杷葉提取物中黃酮和多酚可能為主要抗氧化活性物質(zhì)。

2.2? 6種枇杷葉提取物止咳祛痰活性研究

2.2.1? 6種枇杷葉提取物止咳祛痰活性測(cè)定結(jié)果? 由表2可見，給藥組和陰性對(duì)照生理鹽水比較，在延長(zhǎng)咳嗽潛伏期方面，除粗多糖與對(duì)照無顯著差異外，其他枇杷葉提取物與陰性對(duì)照差異顯著，其中黃酮提取物和三萜酸提取物的止咳祛痰效果相近，多糖提取物效果較差;在減少咳嗽次數(shù)方面，各種提取物效果均顯著高于陰性對(duì)照，其中黃酮提取物效果較好。總體而言，枇杷葉提取物具有止咳作用，黃酮提取物效果較好。給藥組和陰性對(duì)照比較，除粗多糖、粗三萜酸提取物外，其他提取物均顯著促進(jìn)小鼠呼吸道酚紅的排泌量，其中精制三萜酸和精制黃酮效果相近，其次為粗黃酮，說明枇杷葉提取物具有祛痰作用，黃酮和三萜酸提取物均有較好的祛痰效果。

提取物純化前后活性比較顯示，黃酮純化后咳嗽潛伏期顯著延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)有一定下降，酚紅排泌量有一定升高，說明黃酮純化后止咳祛痰活性升高;三萜酸純化后潛伏期顯著延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)沒有差異，酚紅排泌量顯著升高，說明純化后止咳祛痰活性升高;多糖純化后潛伏期顯著延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)有所下降，酚紅排泌量顯著升高，說明純化后止咳祛痰活性升高。3類成分經(jīng)過純化后活性成分含量升高，止咳祛痰活性也相應(yīng)有所升高。

2.2.2? 6種枇杷葉提取物止咳祛痰活性與黃酮、總萜含量的相關(guān)性分析? 對(duì)小鼠咳嗽次數(shù)、咳嗽潛伏期、酚紅濃度與枇杷葉提取物中黃酮、總酚和總萜含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示黃酮與咳嗽次數(shù)顯著相關(guān)，總萜與咳嗽潛伏期顯著相關(guān)，此外，相關(guān)性分析還顯示咳嗽潛伏期與酚紅濃度顯著相關(guān)，推測(cè)總萜與酚紅濃度應(yīng)存在一定的相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果說明，黃酮能減少咳嗽次數(shù)，總萜能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，且兩者均有一定的祛痰作用。

3? 小結(jié)

枇杷葉黃酮提取物、三萜酸提取物的抗氧化活性較高，多糖提取物抗氧化活性較差。黃酮、總酚含量均與FRAP法測(cè)定的氧化還原能力正相關(guān)，與DPPH的EC50值負(fù)相關(guān)，即與DPPH自由基清除能力正相關(guān)。總萜含量與FRAP法測(cè)定的氧化還原能力、DPPH自由基清除能力無相關(guān)關(guān)系。總萜含量與黃酮含量有極顯著相關(guān)關(guān)系，與總酚含量無顯著相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，黃酮、總酚有較強(qiáng)的抗氧化活性，而總萜沒有強(qiáng)的抗氧化活性。

在止咳、化痰方面，枇杷葉提取物中黃酮、三萜酸等具有較好的作用，精制黃酮、精制三萜酸效果好于陽(yáng)性對(duì)照0.2%氯化銨。其中黃酮能減少咳嗽次數(shù)，總萜能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，且兩者均有一定的祛痰作用。提取物通過精制，能富集有效成分，提高枇杷葉提取物的抗氧化活性和止咳祛痰活性。從試驗(yàn)結(jié)果可以推斷，枇杷葉提取物中黃酮、多酚類成分是抗氧化的主要成分，止咳化痰作用的主要成分除了三萜酸類之外，黃酮類成分也有同樣的重要作用，由于黃酮類成分水溶性好，藥效更容易發(fā)揮，而三萜酸類成分的水溶性差，在實(shí)際使用中作用可能難以發(fā)揮，要想提高其功效應(yīng)該想辦法提高其溶解度。枇杷葉多糖類成分不是止咳和抗氧化的主要成分。綜合來看要提取枇杷葉的功效成分，用常規(guī)的水煎煮應(yīng)該不是好的辦法，要充分發(fā)揮枇杷葉的功效，應(yīng)該有針對(duì)性地提取純化，采用一定的手段加工成一定的制劑，提高其藥效。

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收稿日期：2018-06-29

作者簡(jiǎn)介：黃素華（1968-），女，福建龍巖人，副教授，碩士，主要從事天然活性物質(zhì)、植物生物技術(shù)研究，