低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗葉形指數(shù)及生長(zhǎng)素的響應(yīng)

李琦瑤　王樹(shù)聲　劉光亮　周培祿　鄭璇　曾文龍　陳志厚　陳愛(ài)國(guó)

摘要：為研究低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗葉形及生長(zhǎng)素含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，采用盆栽試驗(yàn)研究4 ℃低溫脅迫下及低溫后恢復(fù)常溫生長(zhǎng)的煙苗地上部生物量、葉面積、葉形指數(shù)、不同部位葉片生長(zhǎng)素含量以及生長(zhǎng)素外流蛋白家族基因NtPINs表達(dá)的變化情況。結(jié)果表明，低溫脅迫下煙苗地上部生物量較同期對(duì)照組極顯著減小，恢復(fù)常溫后雖能繼續(xù)生長(zhǎng)但生物量仍低于同期對(duì)照組;低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)煙苗的葉形指數(shù)極顯著高于同期對(duì)照組;低溫脅迫24 h時(shí)，煙苗莖尖新生葉IAA含量較對(duì)照組極顯著升高，但自下而上第4張葉片的IAA含量較對(duì)照組極顯著降低，恢復(fù)生長(zhǎng)8 d時(shí)不同部位葉片IAA含量均大幅升高;qRT-PCR結(jié)果顯示，低溫脅迫24 h時(shí)，煙苗莖尖新生葉NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9表達(dá)水平均較同期對(duì)照極顯著下調(diào);低溫下施加外源生長(zhǎng)素α-萘乙酸（NAA）、生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA），常溫下施加NPA可明顯影響煙苗的葉形指數(shù)。因此，低溫脅迫導(dǎo)致煙苗地上部生長(zhǎng)素從莖尖新生葉向莖基部極性運(yùn)輸?shù)臏p少是煙苗葉片形態(tài)響應(yīng)低溫脅迫的生理機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：煙草;低溫脅迫;葉形指數(shù);生長(zhǎng)素;NtPINs基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S572.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0060-06

收稿日期：2018-04-24

煙草是原產(chǎn)于亞熱帶的喜溫作物，早春季節(jié)的低溫冷害是我國(guó)福建、江西等地南方煙區(qū)在移栽期常見(jiàn)的問(wèn)題之一，易導(dǎo)致煙苗在大田前期生長(zhǎng)遲緩、早花和葉形狹長(zhǎng)等現(xiàn)象[1]。葉片是煙草最主要的商品器官，其發(fā)育情況在很大程度上決定著煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。葉形態(tài)是植株形態(tài)建成的重要組成部分[2]，葉在空間三維軸向上的極性包括基-頂軸、中-側(cè)軸和背-腹軸[3]，而葉在基-頂軸和中-側(cè)軸2個(gè)軸向上的協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，決定了葉具有一定的葉形指數(shù)（長(zhǎng)/寬）[4]。植物受到低溫等逆境脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)激素調(diào)節(jié)引發(fā)相關(guān)生理反應(yīng)來(lái)適應(yīng)環(huán)境[5]。生長(zhǎng)素（IAA）是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素[6]，其分布、極性運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)植物葉片發(fā)育及形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。李林川等研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸在葉片形態(tài)發(fā)生和兩側(cè)對(duì)稱性生長(zhǎng)中具有重要作用[8];用生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑處理局部葉片，可導(dǎo)致該部位生長(zhǎng)素含量升高，葉脈發(fā)達(dá)，可見(jiàn)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸與微管組織分化密切相關(guān)，進(jìn)而影響葉片脈型[9]。此外，IAA還可以誘導(dǎo)一些抗寒基因的快速表達(dá)。因此也有研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素代謝屬于植物抗寒調(diào)控系統(tǒng)的一部分[10]。

如上所述，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸對(duì)植物葉片形態(tài)具有非常重要的作用。Fujino等發(fā)現(xiàn)，水稻突變體中生長(zhǎng)素含量的變化最終導(dǎo)致窄葉突變性狀的出現(xiàn)[11]，在已克隆的3個(gè)窄葉基因NAL7、NAL1和NRL1中，NAL7、NAL1分別涉及生長(zhǎng)素的生物合成、極性運(yùn)輸;而NRL1則通過(guò)調(diào)控葉片維管組織的發(fā)育影響葉片寬度。當(dāng)前的研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素參與煙苗非生物脅迫主要與煙草根系生長(zhǎng)有關(guān)[12-13]，而關(guān)于葉形變化與生長(zhǎng)素關(guān)系的研究未見(jiàn)報(bào)道，外源生長(zhǎng)素及生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑對(duì)葉形的影響也尚不清楚。因此，本試驗(yàn)以我國(guó)主栽品種同時(shí)也是低溫敏感型品種K326為材料[14]，研究低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗地上部生物量、葉面積、葉形指數(shù)、不同部位葉片生長(zhǎng)素含量及NtPINs家族基因表達(dá)的變化情況，分析不同濃度外源生長(zhǎng)素 α- 萘乙酸（NAA）和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑1-萘氨甲酰苯甲酸（NPA）處理下煙苗葉形的變化規(guī)律，旨在揭示苗期煙草葉形發(fā)育對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為K326，由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)煙草種質(zhì)資源子平臺(tái)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所）提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年1—4月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地進(jìn)行。挑選顆粒飽滿的種子，用水浸泡后，用70%乙醇消毒5 min，用水沖洗后在水中浸泡24 h，然后播種于裝有由草炭和蛭石（體積比為1 ∶ 1）混勻后組成的育苗基質(zhì)的育苗盤中，播種后將其置于溫室內(nèi)，自然光照，每天澆水，待幼苗出土后，將幼苗移栽至裝有相同基質(zhì)的假植盤中繼續(xù)生長(zhǎng)。選取假植盤中長(zhǎng)勢(shì)一致的7葉苗齡煙苗移栽至裝有等量基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽（上口內(nèi)徑為8 cm，底部?jī)?nèi)徑為6 cm，高度為10 cm，缽底有孔）中，置于晝夜時(shí)段各12 h（晝：08：00—19：59;夜：20：00 —次日07：59），溫度為（25±1） ℃的人工智能氣候箱（SPX-250B-G，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）中還苗2 d。設(shè)置如表1所示的處理。

表1中的低溫處理時(shí)間由筆者所在課題組前期研究低溫脅迫對(duì)煙苗葉形的影響時(shí)篩選確定[15]。各處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)選取長(zhǎng)勢(shì)一致且葉片大小相近的煙苗5株，用于地上部生物量、葉形指標(biāo)、生長(zhǎng)素含量的測(cè)定以及NtPINs家族基因表達(dá)的定量分析。

為研究生長(zhǎng)素對(duì)煙苗葉形的影響，采用葉面噴施法篩選合適的NAA、NPA濃度，分別對(duì)25、4 ℃處理24 h后的煙苗進(jìn)行外源NAA、NPA噴施。配制100、200、500、1 000 nmol/L NAA（1 mol/L NaOH溶解），對(duì)4 ℃處理24 h后恢復(fù)到常溫生長(zhǎng)的煙苗于次日08：00利用小型噴霧器均勻噴施，以葉面掛有水珠為度，每2 d噴1次;配制150、300、600、1 200 nmol/L NPA（二甲基亞砜溶解），對(duì)25 ℃處理24 h后的煙苗于相同時(shí)間噴施。每個(gè)噴施濃度設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)選取長(zhǎng)勢(shì)一致且葉片大小相近的煙苗5株，8 d后記錄自下而上第4張葉片的葉長(zhǎng)、葉寬，計(jì)算葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)/葉寬），確定外施NAA和NPA的適宜噴施濃度。利用篩選出的適宜噴施濃度，以25 ℃處理24 h后噴施等量去離子水的煙苗為對(duì)照，對(duì)25 ℃處理24 h后的煙苗分別噴施NAA、NPA，對(duì) 4 ℃ 處理24 h后的煙苗分別噴施NAA、NPA，8 d后記錄自下而上第4張葉片的葉長(zhǎng)、葉寬，計(jì)算葉形指數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)選取長(zhǎng)勢(shì)一致且葉片大小相近的煙苗5株。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 地上部生物量的測(cè)定 地上部生物量的測(cè)定參考趙永長(zhǎng)等的方法[16]，用蒸餾水將植株沖洗干凈，擦干后剪取地上部，稱其鮮質(zhì)量，然后于105 ℃條件下殺青15 min，75 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，稱其干質(zhì)量。

1.3.2 葉形指數(shù)和葉面積的測(cè)量 測(cè)量自下而上第4張葉片的葉長(zhǎng)、葉寬，計(jì)算葉面積（葉長(zhǎng)×葉寬×0.634 5）和葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)/葉寬）。測(cè)量方法參考YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法》。

1.3.3 生長(zhǎng)素含量測(cè)定 生長(zhǎng)素含量測(cè)定參考Song等的方法[17]，采集各處理莖尖新生葉和自下而上第4張葉片（靠近主脈附近）各0.1 g，放入液氮中速凍。將樣品放置于液氮預(yù)冷的研缽中，快速研磨至粉末后，加入80%甲醇繼續(xù)研磨，將研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入少量80%甲醇沖洗研缽，定容至20 mL，4 ℃浸提過(guò)夜。8 000 r/min、4 ℃離心10 min后取出上清液，向殘?jiān)屑尤?.5 mL 80%甲醇繼續(xù)浸提3 h，重復(fù)上述操作，合并2次上清液。用氮吹儀濃縮至05 mL左右，加入0.5 mL石油醚，振蕩混勻，移去上層醚相，保留下層水相，重復(fù)上述操作3次。向下層水相中加入 1 mol/L HCl將pH值調(diào)至2.5左右，加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取后的乙酸乙酯層，用氮吹儀吹干，用流動(dòng)相（100%甲醇：1%乙酸體積比為4 ∶ 6）定容至0.5 mL，然后用針頭式過(guò)濾器將其過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)待測(cè)。儀器設(shè)置條件：Rigol L3000高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），KQ2200DE數(shù)控超聲波清洗器，吲哚乙酸（IAA）標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自Sigma公司）。

1.3.4 NtPINs家族基因的引物設(shè)計(jì)及qRT-PCR分析 另取各處理的莖尖新生葉于液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取?？俁NA的提取采用Trizol法，cDNA合成采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒[18]，以不同處理后的樣品逆轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋5倍后為模板，各基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT方法[19]進(jìn)行定量分析。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)反應(yīng)40次;熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。內(nèi)參NtActin[19]及NtPINs家族基因引物序列見(jiàn)表2[20]，引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2013和SAS 9.4對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)分析及圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗地上部生物量的變化

從圖1可以看出，處理12、24 h時(shí)，處理組煙苗地上部鮮質(zhì)量較同期對(duì)照組極顯著降低（P<0.01）;處理3、9 d時(shí)，對(duì)照組地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量開(kāi)始增大，而處理組雖較低溫脅迫階段有所增大但仍低于同期對(duì)照組，處理9 d時(shí)，對(duì)照組和處理組地上部鮮質(zhì)量的差值較處理3 d時(shí)進(jìn)一步增大;煙苗地上部干質(zhì)量的變化趨勢(shì)與鮮質(zhì)量相似，同樣在低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)階段，處理組地上部干質(zhì)量與同期對(duì)照組的差值逐漸增大。

2.2 低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗葉面積和葉形指數(shù)的變化

從表3可以看出，處理12、24 h時(shí)，對(duì)照組和處理組葉長(zhǎng)和葉寬變化不大，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組葉長(zhǎng)和葉寬開(kāi)始明顯增大，而處理組增幅較小。當(dāng)處理3、9 d時(shí)，處理組葉長(zhǎng)顯著小于同期對(duì)照組（P<0.05），葉寬極顯著小于同期對(duì)照組（P<0.01）。

從圖2可以看出，處理12、24 h時(shí)，對(duì)照組和處理組葉面積均未發(fā)生明顯變化。處理9 d時(shí)，對(duì)照組葉面積快速增大，而處理組葉面積雖有所增大， 但增大后的葉面積極顯著低于同期對(duì)照組（P<0.01）;低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)階段，處理組葉形指數(shù)開(kāi)始增大，處理3、9 d時(shí)葉形指數(shù)均極顯著高于同期對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)合葉長(zhǎng)、葉寬數(shù)據(jù)的變化規(guī)律，葉形指數(shù)的增大主要在于葉寬生長(zhǎng)受抑制程度大于葉長(zhǎng)生長(zhǎng)受抑制程度，從而表現(xiàn)為葉形狹長(zhǎng)。

2.3 低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗不同部位葉片IAA含量的變化

從圖3可以看出，處理12、24 h時(shí)，對(duì)照組莖尖新生葉IAA含量無(wú)明顯變化，而處理組莖尖新生葉在低溫脅迫24 h時(shí)IAA含量大幅升高，升高后的IAA含量極顯著高于同期對(duì)照組（P<0.01）。處理9 d時(shí)對(duì)照組和處理組莖尖新生葉IAA含量均大幅升高，但此時(shí)處理組與同期對(duì)照組IAA含量無(wú)顯著差異。處理12、24 h時(shí)，處理組自下而上第4張葉片IAA 含量極顯著低于同期對(duì)照組（P<0.01）。 處理9 d時(shí)對(duì)照組和處理組自下而上第4張葉片IAA含量同樣大幅升高，處理組與同期對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

2.4 低溫脅迫及恢復(fù)生長(zhǎng)后煙苗NtPINs家族基因表達(dá)量的變化

通過(guò)qRT-PCR研究NtPINs家族基因的相對(duì)表達(dá)量。從圖4可以看出，煙苗莖尖新生葉中NtPINs家族基因（NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9）的表達(dá)量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。處理12 h時(shí)，處理組除NtPIN4之外，其余基因的表達(dá)水平均較同期對(duì)照組極顯著下調(diào)（P<0.01）。處理24 h時(shí)，處理組各基因表達(dá)水平繼續(xù)下調(diào)。處理3 d時(shí)，處理組僅NtPIN4基因表達(dá)水平繼續(xù)下調(diào)，其余基因的表達(dá)水平均有所上調(diào);在5個(gè)上調(diào)基因中，除NtPIN3b外，其余4個(gè)基因的表達(dá)水平仍極顯著低于同期對(duì)照組（P<0.01）。處理9 d時(shí)，除NtPIN3外，其余5個(gè)基因的表達(dá)水平仍顯著或極顯著低于同期對(duì)照組。

2.5 外源NAA、NPA濃度對(duì)煙苗葉形指數(shù)的影響

本試驗(yàn)對(duì)4 ℃低溫處理24 h后的煙苗噴施系列濃度NAA進(jìn)行濃度篩選，結(jié)果（圖5-A）發(fā)現(xiàn)，隨著NAA濃度從100 nmol/L增加到1 000 nmol/L，煙苗自下而上第4張葉片的葉形指數(shù)呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為500 nmol/L時(shí)，低溫脅迫后恢復(fù)生長(zhǎng)煙苗的葉形指數(shù)與25 ℃對(duì)照組相當(dāng)，因此在本試驗(yàn)條件下，把NAA的適宜噴施濃度確定為500 nmol/L。對(duì)25 ℃處理24 h后的煙苗施加系列濃度NPA進(jìn)行濃度篩選，結(jié)果（圖5-B）發(fā)現(xiàn)，NPA濃度從150 nmol/L增加到 1 200 nmol/L，葉形指數(shù)呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)NPA濃度為 600 nmol/L 時(shí)，常溫生長(zhǎng)下煙苗葉形指數(shù)與4 ℃對(duì)照組葉形指數(shù)相當(dāng)，因此在本試驗(yàn)條件下，把NPA的適宜噴施濃度確定為600 nmol/L。從圖5-C可以看出，25 ℃處理后噴施 500 nmol/L NAA煙苗的葉形指數(shù)與對(duì)照組（25 ℃處理后噴施去離子水）無(wú)明顯差異，噴施600 nmol/L NPA煙苗的葉形指數(shù)極顯著增大（P<0.01）;4 ℃處理后噴施NAA煙苗的葉形指數(shù)與對(duì)照（25 ℃去離子水處理）無(wú)明顯差異，而噴施NPA煙苗的葉形指數(shù)極顯著增大（P<0.01）。

3 討論

葉片是煙草最重要的商品器官，其能通過(guò)光合作用提供煙株生長(zhǎng)發(fā)育所需要的能量，同時(shí)儲(chǔ)存有機(jī)物和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[2]。研究證明，葉片發(fā)育受體內(nèi)遺傳機(jī)制和體外環(huán)境因子的雙重調(diào)節(jié)[8]。本研究中，常溫生長(zhǎng)的煙苗葉形指數(shù)在生長(zhǎng)過(guò)程中未發(fā)生明顯變化，但低溫后恢復(fù)生長(zhǎng)的煙苗葉形指數(shù)較對(duì)照組極顯著增大，主要在于低溫對(duì)葉寬生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)葉長(zhǎng)生長(zhǎng)的抑制作用，說(shuō)明短期的極端低溫（4 ℃）對(duì)葉片中-側(cè)軸的影響大于基-頂軸，葉寬生長(zhǎng)停滯的響應(yīng)早于葉長(zhǎng)，這與前人研究常態(tài)低溫（10 ℃）對(duì)紅花大金元、云煙87等煙草品種葉形影響的結(jié)果[21]一致。葉片中-側(cè)軸的發(fā)育是指葉片沿中脈向兩側(cè)發(fā)育，即葉片的水平擴(kuò)展，中間部分主要由中脈構(gòu)成，而側(cè)邊部分主要由葉肉和次級(jí)脈構(gòu)成[22]。此前已在擬南芥上發(fā)現(xiàn)，ANGUSTIFOLIA[23]和SPIKE1[24]通過(guò)影響細(xì)胞在中-側(cè)軸方向上的極性擴(kuò)展來(lái)調(diào)控葉片的寬度，而ANGUSTIFOLIA3[25]則通過(guò)調(diào)控中-側(cè)軸方向上的細(xì)胞數(shù)量影響葉片的寬度，但煙草上是否也存在類似的調(diào)控因子，通過(guò)低溫誘導(dǎo)其表達(dá)進(jìn)而影響葉寬還有待進(jìn)一步研究。

生長(zhǎng)素的分布、極性運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)植物葉片發(fā)育和形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用[26]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素主要在植物根尖、莖尖、幼葉和發(fā)育中的種子等生長(zhǎng)活躍的地方合成，然后再運(yùn)輸?shù)狡渌课话l(fā)揮作用[27]。本研究分別測(cè)定生長(zhǎng)素合成部位莖尖新生葉和煙苗自下而上第4張葉片中的IAA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫12 h時(shí)，處理組莖尖新生葉IAA含量略有降低，說(shuō)明低溫對(duì)莖尖新生葉的生長(zhǎng)素合成有一定的抑制作用，這與低溫下煙苗生長(zhǎng)緩慢，頂端優(yōu)勢(shì)較弱等苗相表現(xiàn)一致;但低溫脅迫24 h時(shí)，IAA含量明顯升高，其原因可能與該時(shí)期煙苗頂芽生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)的轉(zhuǎn)變有關(guān)[14]。筆者所在課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低溫后恢復(fù)常溫生長(zhǎng)的煙苗植株形態(tài)在2 d內(nèi)就能恢復(fù)正常[15]，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理9 d時(shí)，處理組煙苗的莖尖新生葉IAA含量大幅升高，說(shuō)明此時(shí)可能是煙苗轉(zhuǎn)向快速生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期[14]。生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸可分為向頂運(yùn)輸和向基運(yùn)輸2種方式。在莖中，由莖尖生長(zhǎng)素合成點(diǎn)向莖基部運(yùn)輸，即從形態(tài)學(xué)的頂端向基部運(yùn)輸，屬于向基運(yùn)輸[28]。生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的流動(dòng)是通過(guò)極性運(yùn)輸完成的，低溫的作用主要是影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸而不是生長(zhǎng)素信號(hào)的傳導(dǎo)[8]。李靜等研究發(fā)現(xiàn)，低溫影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸和側(cè)向運(yùn)輸，而高溫影響生長(zhǎng)素的生物合成[6]。本試驗(yàn)中，處理12、24 h時(shí)，處理組自下而上第4張葉片中IAA含量較同期對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明低溫影響煙苗地上部IAA的極性運(yùn)輸，這與Shibasaki等的研究結(jié)果[29]一致。此外，生長(zhǎng)素外流運(yùn)輸?shù)鞍谆蚣易錚INs的不對(duì)稱分布決定了生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸[30]。本試驗(yàn)中，處理24 h時(shí)，處理組葉片NtPIN1、NtPIN1b、NtPIN3、NtPIN3b、NtPIN4和NtPIN9均較同期對(duì)照組極顯著下調(diào)，處理9 d時(shí)，除NtPIN3基因外，其余各基因的表達(dá)水平均仍顯著或極顯著低于同期對(duì)照，說(shuō)明低溫對(duì)7葉苗齡煙苗生長(zhǎng)素外流蛋白基因表達(dá)的抑制在恢復(fù)生長(zhǎng)的短時(shí)間內(nèi)不會(huì)恢復(fù)。不同基因在低溫脅迫階段及恢復(fù)生長(zhǎng)后的表達(dá)模式各不相同，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Leyser等研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素供給、極性運(yùn)輸及葉片微管發(fā)育之間聯(lián)系緊密，微管模式與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸之間通過(guò)一個(gè)正反饋環(huán)相聯(lián)系[31]。本研究中，低溫脅迫后外施NAA可有效緩解葉片狹長(zhǎng)的趨勢(shì)，而常溫下外施NPA則造成葉片橫向生長(zhǎng)受阻，葉形呈狹長(zhǎng)生長(zhǎng)。由于低溫脅迫下葉寬生長(zhǎng)較葉長(zhǎng)生長(zhǎng)受到的抑制程度更大，且低溫主要影響莖部生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，推測(cè)NPA通過(guò)與生長(zhǎng)素輸出復(fù)合體結(jié)合，特異性地阻斷莖尖合成的生長(zhǎng)素向下極性運(yùn)輸，抑制PIN蛋白從膜內(nèi)到質(zhì)膜的移動(dòng)[32]。Scarpella等研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑處理植物會(huì)使該部位葉脈異常發(fā)達(dá)，而其他部位則因沒(méi)有生長(zhǎng)素的輸入而導(dǎo)致葉脈退化或不明顯[33]，進(jìn)一步證明生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸與維管組織發(fā)育關(guān)系緊密，從而影響葉片形態(tài)。常溫條件下施加外源生長(zhǎng)素，葉形指數(shù)并未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明單就生長(zhǎng)素而言，植物葉形是生長(zhǎng)素供應(yīng)、生長(zhǎng)素輸入輸出及生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面協(xié)同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

低溫脅迫后恢復(fù)生長(zhǎng)的煙苗，與同期對(duì)照組相比，地上部生物量、葉面積減小，葉形指數(shù)增大，葉形狹長(zhǎng);低溫脅迫抑制煙苗葉片生長(zhǎng)素由莖尖新生葉向莖基部的極性運(yùn)輸，外源生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑NPA可調(diào)節(jié)煙苗的葉形指數(shù)，外源生長(zhǎng)素NAA可有效緩解低溫造成煙苗葉形狹長(zhǎng)的趨勢(shì);低溫脅迫下莖尖新生葉生長(zhǎng)素外流蛋白家族基因NtPINs表達(dá)量整體顯著降低。因此推斷，低溫脅迫導(dǎo)致煙苗地上部生長(zhǎng)素從莖尖新生葉向莖基部極性運(yùn)輸?shù)臏p少是煙苗葉片形態(tài)響應(yīng)低溫脅迫的生理機(jī)制之一。

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