達氏鰉親魚群體mtDNA Cyt b基因和D-loop區(qū)的序列特征及遺傳多樣性分析

孔杰　 周洲　 劉偉　 趙鳳　 王金樂

摘要：通過對線粒體細胞色素b（Cyt b）基因和控制區(qū)（D-loop）進行序列特征和遺傳多樣性檢測，分析達氏鰉（Huso dauricus）親魚群體30個個體的序列特征及遺傳多樣性。結(jié)果表明，Cyt b基因長1 138 bp，G+C含量為4703%，共定義單倍型5個、多態(tài)性位點（S）2個，簡約信息位點1個，單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.372，平均核苷酸差異數(shù)（K）為0.384，核苷酸多樣性指數(shù)（π）為 0.000 34;D-loop區(qū)序列全長845 bp，G+C含量為37.41%，共定義單倍型6個，多態(tài)性位點8個，簡約信息位點3個，單倍型多樣性指數(shù)為0.424，平均核苷酸差異數(shù)為1.069，核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 27?；诰€粒體D-loop與Cyt b序列的研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖達氏鰉親魚群體的遺傳多樣性偏低，在利用達氏鰉親魚進行繁殖育苗時要注意近交的影響。

關(guān)鍵詞：達氏鰉;mtDNA;D-loop;Cyt b;遺傳多樣性

中圖分類號： S917.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0040-03

達氏鰉（Huso dauricus）隸屬于硬骨魚綱輻鰭亞綱鱘科鱘亞科鰉屬，是我國重要的大型經(jīng)濟魚類之一。鱘形目魚類屬于多倍體起源魚類，種間極易雜交，易造成種質(zhì)混亂現(xiàn)象，產(chǎn)生種質(zhì)退化風(fēng)險。在養(yǎng)殖中，許多單位將自養(yǎng)鱘魚留作苗種，長期以來忽略了親魚選育的遺傳背景問題，使得養(yǎng)殖群體近交的風(fēng)險增大[1]。因此，為了抑制養(yǎng)殖群體的種質(zhì)退化，保證親魚群體的遺傳力，防止近交衰退造成后代出現(xiàn)成活率降低、長速減慢等問題，有必要了解后備親魚群體的遺傳多樣性。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，簡稱mtDNA）具有母系遺傳、變異率高、進化速度快、無組織特異性的特點，被廣泛應(yīng)用于水生動物的遺傳多樣性和分子鑒定研究中，如鱘鰉魚[1-2]、鯉[3]的分子鑒定，鱘魚[4-6]、沼蝦[7-8]、裂腹魚[9-10]等的遺傳多樣性研究。mtDNA的不同區(qū)域進化速度存在差異，其中，D-loop區(qū)位于tRNAPro和rRNAPhe基因之間的控制區(qū)，不參與編碼蛋白，是整個mtDNA上序列和長度變異最大的區(qū)域，進化速度快，適用于親緣關(guān)系較近的群體間的比較研究和種群水平的差異檢測[11-12];Cyt b基因是編碼基因，進化速度適中，適合魚類的種間、種內(nèi)遺傳分化研究[12-13]。結(jié)合Cyt b、D-loop 2種分子標記可以更準確地進行魚類種內(nèi)遺傳變異分析。

本研究以達氏鰉親魚群體為研究對象，開展mtDNA Cyt b基因和D-loop的序列對比分析，探討2種標記用于達氏鰉遺傳多樣性分析的優(yōu)缺點，旨在研究達氏鰉后備親魚群體的遺傳多樣性，為達氏鰉遺傳選育提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年3月于貴州省水產(chǎn)研究所惠水試驗基地采集達氏鰉親魚群體30尾。剪取尾鰭，固定于無水乙醇中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組提取及擴增

剪取質(zhì)量約為50 mg鱘魚鰭條樣本，加液氮研磨組織后，用磁珠法基因組DNA（動物）抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]進行DNA提取，DNA的質(zhì)量與濃度用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop Lite（Thermo Scientific）紫外分光光度計進行測定。

用于擴增目的片段Cyt b的引物：Cytb-F，5′-GTGACTTGAAAAACCACCGTTG-3′;Cytb-R，5′-CTCCATCTCCGGTTTACAAGAC-3′。用于擴增D-loop區(qū)序列的引物：tpro-F1，5′-AACTCCCAAAGCTAAGATTC-3′;tphe-R2，5′-ATCCTTTAvGTTAAGCTACGC-3′。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，含有100 ng模板DNA，25 μL Premix Taq，各1 μL上下游引物（10 μmol/L），加無菌水補足總體積為50 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 4 min;95 ℃ 45 s，54 ℃/56 ℃（D-Loop/Cyt b）45 s，72 ℃ 90 s/2 min（D-Loop/Cyt b），35個循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用MEGA 6.0軟件進行同源比對和長度確定，并統(tǒng)計DNA序列的堿基組成，轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失位點數(shù)，多態(tài)性位點數(shù)（S），單突變位點，簡約信息位點和平均轉(zhuǎn)換/顛換率。用DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)量（h）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）和Tajimas D值等遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 達氏鰉Cyt b基因和D-loop序列的特征及遺傳變異

測序獲得的30尾達氏鰉Cyt b基因序列的全長為 1 138 bp，定義了5個單倍型。用MEGA 6.0軟件對Cyt b基因序列進行分析顯示，檢測到多態(tài)位點2個，其中簡約信息位點1個，單突變位點1個，為顛換位點（T→C）。在30個個體的Cyt b基因中，A、T/U、C、G堿基的平均含量分別為 26.96%、26.01%、31.82%、15.21%，A+T的含量（52.97%）明顯高于G+C的含量（47.03%），基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為0.472。

測序獲得30尾達氏鰉D-loop區(qū)序列的全長為845 bp，定義了6個單倍型。用MEGA 6.0軟件對D-loop區(qū)進行分析顯示，檢測到多態(tài)位點8個，其中簡約信息位點3個，單突變位點5個，但多態(tài)位點中轉(zhuǎn)換位點2個，顛換位點3個?；谧畲笏迫环ü浪愕霓D(zhuǎn)換/顛換比為2.162。30個個體的 D-loop中，A、T/U、C、G堿基的平均含量分別為30.28%、32.31%、14.92%、22.49%，A+T的含量（62.59%）明顯高于G+C的含量（37.41%）。對比分析可知，Cyt b的簡約信息位點數(shù)、變異位點數(shù)、轉(zhuǎn)換/顛換位點數(shù)及單突變位點數(shù)均比 D-loop少，詳見表1。

2.2 基于Cyt b基因和D-loop序列的遺傳多樣性分析

基于Cyt b基因的達氏鰉親魚養(yǎng)殖群體的多態(tài)性位點數(shù)為2個，單倍型數(shù)量為5個，單倍型多樣性指數(shù)為0.372，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 34，平均核苷酸差異為0.384，Tajimas D值為 -1.613 75。基于D-loop序列的達氏鰉親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點數(shù)為8個，單倍型數(shù)量為6個，單倍型多樣性指數(shù)為0.424，核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 27，平均核苷酸差異數(shù)為1.069，Tajimas D值為-1.576 74（表2）。

3 討論

3.1 達氏鰉群體的mtDNA Cyt b和D-loop序列組成特征

4種堿基組成含量不均一是動物線粒體基因組的共性，G+C含量在21%～50%之間，其中脊椎動物的G+C含量為37%～50%[14]。然而，堿基A+T含量高的線粒體基因在進化中更具優(yōu)勢[15]。本研究結(jié)果顯示，達氏鰉群體Cyt b、D-loop全序列的G+C含量分別為47.03%、37.41%，顯著低于其A+T含量52.97%、62.59%（P<0.01），且D-loop的 A+T含量比Cyt b高近10%，表明達氏鰉群體與其他水生動物，如粗唇[16]、鯽[17]、香魚[18]的線粒體核苷酸堿基含量相似。在本研究中，Cyt b基因的多態(tài)性位點數(shù)量（2個）低于D-loop區(qū)（8個），Cyt b基因的簡約信息位點數(shù)量（1個）低于D-loop區(qū)（3個），也再一次證明了D-loop的進化速率比Cyt b快，這是由于Cyt b基因是蛋白質(zhì)的編碼基因，而 D-loop 是一段非編碼區(qū)，與線粒體基因調(diào)控有關(guān)，進化壓力較小。

從30條長1 138 bp的達氏鰉Cyt b序列中共檢測到2個突變位點，占總分析位點數(shù)的0.2%。從30條長845 bp的 D-loop序列中共檢測到8個突變位點，占總分析位點數(shù)的0.9%。在生物體的進化中，顛換不斷積累，因此轉(zhuǎn)換/顛換值不斷降低，一般認為轉(zhuǎn)換/顛換值小于2時，基因序列突變已經(jīng)達到飽和狀態(tài)[19]。在本研究中，基于最大似然法計算 Cyt b、D-loop的轉(zhuǎn)換/顛換值（R值）分別為0.472、2.162，Cyt b的R值小于2，D-loop的R值略大于2，表明Cyt b發(fā)生的突變已經(jīng)達到飽和，而D-loop還有進一步突變的空間。由此可見，D-loop更適合用來進行達氏鰉的種內(nèi)遺傳分析。

3.2 達氏鰉親魚群體遺傳多樣性的分析

單倍型多樣性指數(shù)及核苷酸多樣性指數(shù)是衡量種群遺傳變異的重要指標，其數(shù)值越大，代表種群遺傳多樣性越豐富[20]，遺傳多樣性越豐富，該物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強[21]。由于核苷酸多樣性指數(shù)考慮了各種單倍型在種群中所占的比例，因此在衡量一個種群的多態(tài)性程度時，比單純的單倍型多樣性指數(shù)要準確，π值高，則說明種群的遺傳多樣性較高[22]。牛翠娟等通過D-loop序列對達氏鰉群體的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果顯示，單倍型多樣性指數(shù)為0.507，核苷酸多樣性指數(shù)為0.002，并得出遺傳多樣性偏低的結(jié)論[6]。王巍等對4種鱘魚的遺傳多樣性分析的結(jié)果顯示，施氏鱘（π=0.002，Hd=0.608）、小體鱘（π=0.010，Hd=0.572）、西伯利亞鱘（π=0.005，Hd=0.706）、俄羅斯鱘（π=0.005，Hd=0.352）4種后備親魚群體的遺傳多樣性偏低[5]。從其他魚類的遺傳多樣性來看，香魚群體D-loop的π=0.001 99，Hd=0.810 75，Cyt b的π=0.000 28，Hd=0.323，遺傳水平較低[18];赤眼鱒野生群體D-loop的 π=0.028 4，Hd=0.963，Cyt b的π=0.042 6，Hd=0.971 0，赤眼鱒群體具有較高的遺傳多樣性水平[12]。本研究基于mtDNA Cyt b基因、D-loop序列，研究達氏鰉親魚群體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，Cyt b的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性（π=0.000 34，Hd=0372）和D-loop的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)（π=0.001 27，Hd=0.424）均低于以上各種魚類的相應(yīng)遺傳參數(shù)，表明本研究中的30尾達氏鰉親魚群體的遺傳多樣性較低。本研究結(jié)果初步反映了達氏鰉親魚群體的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳變異水平，可以采用核基因組分子標記如簡單重復(fù)序列（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等聯(lián)合分析，以更全面地展示該群體的遺傳多樣性，為親魚選育、苗種培育提供理論依據(jù)。

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