鼠、人源巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立及比較

祁芳菲 樓 濱 楊 青

(1復旦大學生命科學學院生物化學系 上海 200433; 2復旦大學藥學院藥理學與生物化學教研室 上海 201203)

心肌梗死和卒中是目前致死率最高的兩大心腦血管疾病(cardiovascular disease,CVD),其本質(zhì)原因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)[1]。巨噬細胞的泡沫化是早期AS形成的標志之一[2-4]。研究表明泡沫細胞的形成過程與動脈硬化斑塊區(qū)的炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡等密切相關(guān)[5-8]。建立穩(wěn)定的泡沫細胞模型對研究動脈硬化發(fā)生發(fā)展的機制至關(guān)重要[9-10]。

目前構(gòu)建泡沫細胞模型最有效的手段是使用氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL)孵育單核-巨噬細胞,單核-巨噬細胞以THP-1和RAW264.7最為常用[11-12]。利用巨噬細胞源性泡沫細胞模型進行的研究常應(yīng)用不同的泡沫細胞模型[13-14]。RAW264.7巨噬細胞普遍用于研究泡沫細胞形成過程中的炎癥信號通路以及相關(guān)分子作用機制[15-17];而THP-1巨噬細胞通常用于研究細胞凋亡、自噬及脂質(zhì)代謝異常等[14,18-19]。明確不同來源的泡沫細胞的生物學特征(如炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等)尤為重要。

本研究旨在使用ox-LDL分別孵育 RAW264.7和THP-1 來源的巨噬細胞,以模擬體內(nèi)泡沫細胞的形成與發(fā)展過程。從泡沫細胞中炎癥因子的分泌、細胞凋亡以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平來比較不同來源的巨噬細胞源性泡沫細胞模型的生物學特征。催化色氨酸(tryptophan,Trp)分解代謝的犬尿氨酸代謝途徑(kynurenine pathway,KP)在AS發(fā)生中起重要作用,但作用機制尚不明確[28]。吲哚胺2,3-雙加氧化酶1(indoleamine 2,3 dioxygenase 1,IDO1)作為KP首個限速酶,其在不同泡沫細胞模型中的活性變化及系統(tǒng)比較在國內(nèi)外仍無報道。本研究首次在不同巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)檢測并比較IDO1的活性變化,旨在為AS的發(fā)病機制及治療方法提供新思路。

材 料 和 方 法

試劑和藥品人類單核細胞系THP-1為復旦大學藥學院樓濱教授所贈;鼠單核細胞系RAW264.7(中國科學院細胞庫);ox-LDL(上海經(jīng)科化學科技有限公司);佛波酯(PMA)(美國Sigma-Aldrich公司);油紅O(上海源葉生物科技有限公司);RPMI 1640 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibico公司);細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊盛生物科技有限公司);MDA檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司);Trizol(美國Thermo Fisher公司);AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。其余試劑為國產(chǎn)分析純或色譜純。

儀器和設(shè)備Calibur流式細胞儀(美國BD公司);CFX96 Touch基因擴增儀(美國Bio-Rad公司);超低溫冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司);高效液相色譜儀(美國Agilent公司);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);多功能酶標儀(美國BioTek公司)。

THP-1細胞培養(yǎng)及泡沫細胞模型構(gòu)建在恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中,采用含有RPMI 1640培養(yǎng)基(含50 mg/mL 鏈霉素、50 U/mL青霉素和20% FBS)培養(yǎng)THP-1單核細胞至指數(shù)生長期。按照104～105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。為使THP-1單核細胞分化形成THP-1巨噬細胞,更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞,并加入10 nmol/L PMA處理細胞48 h。對照組用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。建模組待細胞貼壁后,吸去上清,更換為含3% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,并加入ox-LDL(終濃度為25 mg/L)處理24 h,即得人源THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞模型[30]。

RAW264.7細胞培養(yǎng)及泡沫細胞模型構(gòu)建在恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5 %CO2)中,采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含50 mg/mL 鏈霉素、50 U/mL青霉素和10% FBS)培養(yǎng)RAW264.7細胞至指數(shù)生長期。按照104～105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。對照組用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。建模組待細胞貼壁后,吸去上清,更換為含3% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,并加入ox-LDL (終濃度為25 mg/L)處理24 h,即得鼠源RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型[31]。

油紅O染色將RAW264.7和THP-1巨噬細胞均勻接種于6孔板內(nèi),待ox-LDL誘導建模結(jié)束后吸去上清,用預(yù)冷的PBS多次洗滌細胞,在細胞表面加入4 %甲醛固定液,室溫孵育30 min后用PBS洗滌,再用預(yù)冷的60%異丙醇清洗1次。在細胞表面加入60%油紅O染色液,室溫下染色30 min。去除細胞表面油紅O染色液,并用預(yù)冷的60%異丙醇清洗2次,將油紅O染料完全洗凈。加入200 μL PBS,在熒光倒置顯微鏡下觀察泡沫細胞形態(tài)及脂質(zhì)富集情況[13]。

qRT-PCR檢測炎癥因子表達利用Trizol法提取RAW264.7和THP-1巨噬細胞總RNA,取2 μg RNA,利用基因擴增儀進行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA模板,按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書對樣品進行處理,使用CFX96Touch基因擴增儀進行qRT-PCR,在Bio-Rad CFX Manager軟件中分析結(jié)果[13]。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集經(jīng)ox-LDL處理的RAW264.7 和 THP-1巨噬細胞,4 ℃下300×g離心100 min后收集沉淀,加入1×結(jié)合緩沖液(100 μL)輕輕吹打,待沉淀完全溶解后分別加入Annexin V-FITC (5 μL)和PI(10 μL),劇烈震蕩,混勻細胞,室溫下避光靜置15 min,加入1×結(jié)合緩沖液,通過FACS Calibur流式細胞儀進行流式細胞術(shù)分析[13]。

ROS水平測定將RAW264.7和 THP-1巨噬細胞均勻接種在96孔板內(nèi),加入ox-LDL孵育24 h后,更換RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的DCFH-DA工作液(1∶3 000稀釋),37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)20 min。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復洗滌細胞,以488 nm為激發(fā)波長,530 nm為檢測波長,利用熒光酶標儀檢測RAW264.7 和 THP-1巨噬細胞內(nèi)熒光強度,以示ROS水平。

MDA含量測定收集經(jīng)ox-LDL處理的RAW264.7和THP-1巨噬細胞,沉淀于離心管內(nèi),充分裂解細胞,12 000×g離心10 min,棄沉淀,利用BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度并計算MDA單位重量的蛋白質(zhì)含量。在離心管中加入100 μL樣品上清,加入不同濃度的標準品繪制標準曲線,隨后加入等體積的MDA檢測工作液。在100 ℃預(yù)熱的干浴鍋內(nèi)加熱15 min,冷卻至室溫,1 000×g離心10 min后棄沉淀,在96孔板內(nèi)加入上清,熒光酶標儀以532 nm為檢測波長測定吸光度值,計算MDA摩爾濃度。根據(jù)說明書計算公式,計算最初RAW264.7和THP-1巨噬細胞的MDA含量。

HPLC檢測IDO1活性分別取100 μL經(jīng)ox-LDL處理的RAW264.7和THP-1巨噬細胞上清液,去蛋白質(zhì)處理后上機測定Trp和犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)含量,測定值為實際濃度的1/3。色譜條件:流動相為乙酸鈉-乙酸溶液(15 mmol/L,含體積分數(shù)為6%的乙腈,pH=3.6);色譜柱為Agilent Technologies C18柱(250 nm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;進樣體積20 μL;流速1.0 mL/min;Trp和Kyn的紫外監(jiān)測波長分別為280和360 nm[32]。根據(jù)Trp和Kyn的峰面積,利用標準曲線法計算RAW264.7和THP-1巨噬細胞上清中Trp和Kyn含量,以(Kyn/Trp濃度)×100來表示細胞上清中IDO1活性。

結(jié) 果

鼠、人源巨噬細胞源性泡沫模型建立及泡沫細胞形態(tài)變化油紅O染色結(jié)果如圖1所示。對照組鼠源RAW264.7巨噬細胞內(nèi)未見紅色脂質(zhì)富集,細胞形態(tài)為梭形;而經(jīng)過ox-LDL誘導的細胞內(nèi)可見大量紅色脂質(zhì)富集,呈環(huán)狀整齊排列在細胞膜內(nèi)側(cè),細胞多為扁圓形,這一現(xiàn)象表明泡沫細胞已經(jīng)形成(圖1A)。對照組人源THP-1巨噬細胞幾乎無紅色脂質(zhì)沉積,細胞型態(tài)為圓形;經(jīng)ox-LDL誘導后,紅色脂質(zhì)明顯增多,在細胞內(nèi)均勻散落分布,細胞仍為圓形成團聚集,表明泡沫細胞已經(jīng)形成(圖1B)。兩種巨噬細胞源性泡沫細胞模型均構(gòu)建成功,并存在不同的脂滴分布及形態(tài)變化。

ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞內(nèi)炎癥因子的影響qRT-PCR的結(jié)果如圖2所示。對照組鼠源RAW264.7巨噬細胞內(nèi)IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β等4種炎癥因子在mRNA水平的表達均偏低,經(jīng)ox-LDL誘導后,細胞內(nèi)炎癥因子的表達均升高,其中IL-10、IL-6和TGF-β表達大幅度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2A)。對照組人源THP-1巨噬細胞中,IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β表達水平較低;經(jīng)ox-LDL誘導后,IL-10、IL-1β和TGF-β表達均明顯上調(diào)(P<0.05,圖2B),IL-6表達雖有近2倍的升高,但差異無統(tǒng)計學意義。ox-LDL會引起不同來源的巨噬細胞內(nèi)炎癥因子表達升高,并加劇巨噬細胞中的炎癥反應(yīng)。

ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞凋亡的影響利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡比率,并對3次獨立實驗的各組別總細胞凋亡率(晚期細胞與早期細胞凋亡百分比之和)進行統(tǒng)計(圖3)。發(fā)現(xiàn)鼠源RAW264.7巨噬細胞自然凋亡率為9.57%±0.44%,經(jīng)ox-LDL處理后細胞凋亡率有所升高(10.36%±0.68%),但差異無統(tǒng)計學意義(圖3A)。人源THP-1巨噬細胞自然凋亡率為11.26%±8.71%,經(jīng)ox-LDL處理24 h后細胞凋亡比率顯著增加(26.41%±13.15%,P<0.05,圖3B)。ox-LDL可引起兩種不同來源的巨噬細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡,其中人源THP-1巨噬細胞對ox-LDL更為敏感。

RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h to form foam cells.Data were based on at least 3 independent experiments.

圖1 鼠、人源巨噬細胞及泡沫細胞的油紅染色結(jié)果(×600)
Fig 1 Oil-red staining of mouse/human macrophagesand foam cells (×600)

ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞ROS和MDA的影響ROS檢測結(jié)果顯示,對照組鼠源RAW264.7巨噬細胞的ROS熒光強度為48.79±6.41,加入ox-LDL共孵育24 h后,細胞內(nèi)ROS熒光強度達到56.86±9.12,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4A)。對照組人源THP-1巨噬細胞的ROS熒光強度為46.69±3.69,加入ox-LDL共孵育24 h后,細胞內(nèi)ROS熒光強度顯著升高(59.50±12.33,P<0.05,圖4B)。MDA檢測結(jié)果顯示,對照組鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬細胞中MDA含量分別為(0.511±0.219)×103和(1.30±0.081)×103μmol/mg,加入ox-LDL誘導后,兩種來源巨噬細胞內(nèi)MDA水平均明顯升高(P<0.05,圖4C、4D)。ox-LDL可促使不同來源巨噬細胞中ROS和MDA上調(diào),進而引發(fā)細胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.The mRNA levels were measured by qRT-PCR.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P< 0.05.

圖2 ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞內(nèi)炎癥因子mRNA水平的影響
Fig 2 The effect of ox-LDL on the mRNA levels of inflammatory factors in mouse/human macrophages

RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.PI was used for nucleus staining’s and Annexin V-FITC was used for cytomembrane staining.The first quadrant represented cellular debris and damaged cells.The second and the third quadrant represented apoptosis cells in late or early stage respectively.The fourth quadrant represented normal cells.The total cell apoptosis was the sum of the percentage of late cell and early cell apoptosis.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P< 0.05.

圖3 ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞凋亡的影響
Fig 3 The effect of ox-LDL on the apoptosis of mouse/human macrophages

RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P< 0.05.

圖4 ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞內(nèi)ROS和MDA水平的影響
Fig 4 The effect of ox-LDL on the levels of ROS and MDA in mouse/human macrophages

ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞內(nèi)IDO1活性的影響HPLC檢測結(jié)果顯示,相較于對照組,鼠源RAW264.7巨噬細胞加入ox-LDL導致Trp濃度下降近60%,此時Kyn濃度有所升高,但差異無統(tǒng)計學意義。KP代謝限速酶IDO1活性由Kyn/Trp來表示[20]。與對照組相比,加入ox-LDL使鼠源RAW264.7巨噬細胞內(nèi)IDO1活性升高近2.4倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖5A)。人源THP-1巨噬細胞中加入ox-LDL誘導后,細胞內(nèi)Trp被消耗約40%,隨著Kyn濃度升高,IDO1活性(Kyn/Trp)升高近3倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖5B,表2)。ox-LDL可上調(diào)RAW264.7和THP-1巨噬細胞內(nèi)IDO1活性并激活KP。

RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.The activity of IDO1 was represented by the ratio of Kyn/Trp.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P< 0.05.

圖5 ox-LDL對鼠、人源巨噬細胞中KP代謝限速酶IDO1活性的影響
Fig 5 The effect of ox-LDL on the activity of IDO1 (KP rate-limiting enzyme) in mouse/human macrophages

IndexRAW264.7RAW264.7+ox-LDLTHP-1THP-1+ox-LDLTrp(μmol/L)45.4±35.313.6±11.314.16±6.138.31±3.84Kyn(μmol/L)0.46±0.130.53±0.241.52±1.302.30±1.18(Kyn/Trp)×1002.82±1.736.75±2.4611.2±8.0329.6±6.07

討 論

AS是一種由不良的適應(yīng)性免疫反應(yīng)所驅(qū)動的慢性炎癥疾病[21]。單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞參與AS的發(fā)生、發(fā)展[22]。ox-LDL是公認的誘導血管內(nèi)壁炎癥反應(yīng)的主要危險因素之一,可以誘導單核細胞分化成巨噬細胞,并激活巨噬細胞內(nèi)的免疫反應(yīng),隨后引發(fā)脂質(zhì)積累和泡沫細胞形成,在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[23-24]。ox-LDL誘導構(gòu)建的不同泡沫細胞模型常應(yīng)用于不同的研究中,因此明確不同來源的泡沫細胞在AS發(fā)生、發(fā)展過程中的生物學特征,對于進一步闡述AS機制具有重要意義[13-14]。本研究通過給予巨噬細胞ox-LDL成功建立鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬細胞泡沫細胞模型。通過油紅O染色實驗發(fā)現(xiàn),大量紅色脂質(zhì)顆粒在不同來源的巨噬細胞內(nèi)富集,但分布略有不同,這與以往的研究結(jié)果相符合。巨噬細胞大量吞噬脂蛋白形成泡沫細胞后,會分泌各種細胞因子,從而進一步影響局部炎癥反應(yīng)以及細胞黏附、增殖等特征,最終導致AS病灶形成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以引發(fā)RAW264.7和THP-1巨噬細胞大量分泌IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β,從而在細胞內(nèi)引發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng),但這些細胞因子參與的炎癥信號傳導通路目前尚不清楚。

ox-LDL會通過一些信號通路誘發(fā)較強的細胞毒性作用,最終可導致巨噬細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞的退化凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)相同濃度ox-LDL誘導后,THP-1凋亡比率增加近2倍,而RAW264.7凋亡比率基本不變。這一結(jié)果證明,ox-LDL會引起不同來源的巨噬細胞產(chǎn)生不同的凋亡特性,THP-1對ox-LDL引起的細胞凋亡更為敏感。在今后的研究中,選取人源THP-1巨噬細胞探索ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡信號通路更具科學性。LDL是導致AS病灶區(qū)脂質(zhì)堆積的主要原因之一,而ox-LDL含有的氧化成分會對巨噬細胞造成額外的氧化損傷,過多攝入ox-LDL更易促使巨噬細胞破裂死亡,最終加速AS斑塊形成[27]。本研究結(jié)果顯示,加入ox-LDL不僅會造成鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,同時也顯著上調(diào)細胞內(nèi)ROS 和MDA表達,從而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化并直接對細胞造成損傷。因此,減少巨噬細胞的氧化損傷,增強巨噬細胞的抗氧化能力對AS的防治與治療具有重要意義。

活化的KP對AS發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要,IDO1作為KP的首個限速酶,其活性與早期AS發(fā)生呈顯著正相關(guān)[28-29]。在鼠源RAW264.7巨噬細胞和人源THP-1巨噬細胞中,ox-LDL都會引起IDO1活顯著上調(diào),表明ox-LDL會激活不同來源的巨噬細胞的KP。同時在細胞水平上證實,KP代謝限速酶IDO1活性與泡沫細胞的形成呈正相關(guān),我們認為IDO1活性可以作為泡沫細胞形成的標志,但其是否可以作為AS形成的生物指標還有待進一步研究。抑制IDO1活性或KP途徑的代謝產(chǎn)物或可為阻斷AS的發(fā)展提供新的治療思路,IDO1抑制劑或?qū)⒊蔀轭A(yù)防AS的新型治療藥物。

綜上所述,RAW264.7和THP-1細胞均可為研究AS發(fā)生發(fā)展機制提供穩(wěn)定可靠的泡沫細胞模型,不同來源的泡沫細胞模型的生物學特征不完全相同。針對不同的生物學特征,選擇合適的細胞模型,將使今后的研究更具有針對性、科學性。通過ox-LDL對鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬細胞產(chǎn)生的多種影響,我們認為減緩ox-LDL引起的炎癥反應(yīng),防止巨噬細胞內(nèi)的脂質(zhì)富集,減少巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷,選擇性調(diào)控ox-LDL引發(fā)的凋亡和KP激活或?qū)⒊蔀橛行е委烝S的手段。