Kidd血型系統(tǒng)Jk基因非編碼區(qū)3個(gè)新突變位點(diǎn)的多態(tài)性*

章昊， 安文靜， 梁爽， 蘇宇清△， 洪文旭△

1深圳市血液中心(廣東深圳 518035)； 2大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(遼寧大連 116044)

Kidd血型系統(tǒng)是一種極具臨床重要性的血型系統(tǒng)，Kidd血型不合會(huì)引起急性或遲發(fā)性的溶血性輸血反應(yīng)或新生兒溶血病[1-3]。但是，更為可怕的是，Kidd血型系統(tǒng)的抗體極易被臨床漏檢，致使單純地依靠血清學(xué)技術(shù)鑒定Kidd血型具有安全隱患。在這種情況下，建立Kidd血型分子分型技術(shù)來輔助進(jìn)行血型鑒定十分必要，在此之前，研究抗原特異性呈現(xiàn)出缺失或強(qiáng)弱情況下的分子背景具有十分重要的意義[4]。Jk基因位于18號(hào)染色體18q12～q21，Jk基因約有30 kb，11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。Kidd血型系統(tǒng)的主要抗原是Jka和Jkb，組成了4種常規(guī)表型：Jk(a+b+)、Jk(a+b-)、Jk(a-b+)以及Jk(a-b-)，其中Jk(a-b-)在中國(guó)屬于稀有血型[5]。近年來，國(guó)外研究者針對(duì)Jk(a-b-)的分子背景進(jìn)行了一系列的研究，報(bào)道了十余種Jknull基因型[6-7]。國(guó)內(nèi)也曾報(bào)道Jk(a-b-)表型的分子機(jī)制的研究，但是這一突變點(diǎn)是否代表了中國(guó)漢族人群的基因型特點(diǎn)，是否還存在其他不同的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究[8-9]。因此，Kidd血型，尤其是稀有血型Jk(a-b-)表型中無義、錯(cuò)義、突變和缺失等復(fù)雜多樣的突變機(jī)制尚不明確，對(duì)于中國(guó)人群中Jk基因的遺傳背景研究更是有待深入。為此，本研究收集7例Jk(a-b-)標(biāo)本進(jìn)行分子機(jī)制研究，檢出2種Jk隱性基因，Exon 9 c. 896G>A和IVS5-1g>a；同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的突變位點(diǎn)Intron 2 -51 c>t、Exon 3 42 c>a、Intron 3 72 c>t?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年12月，在廣東深圳、惠州地區(qū)發(fā)現(xiàn)的7例Jk(a-b-)表型血液標(biāo)本，以及深圳地區(qū)的115例漢族健康無償獻(xiàn)血者對(duì)照組血液標(biāo)本。靜脈采集血樣5 mL置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)-Na2抗凝管中，4℃保存，待檢。本研究符合深圳市血液中心倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 Kidd血型鑒定試劑(抗-Jka、抗-Jkb，批號(hào)分別為8000217090、8000208862；荷蘭Sanquin公司)；尿素(H2NCONH2)，批號(hào)20121231廣東光華科技股份有限公司；基因組DNA提取試劑盒(MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I，批號(hào)10817000，德國(guó)Roche診斷有限公司)；引物合成均委托大連寶生物公司完成?；驕y(cè)序試劑盒BigDyeTMTerminator Cycle sequencing Ready Reaction kit(美國(guó)ABI公司)

血型血清學(xué)離心機(jī)(日本KUBOTA SEROMATIC II)；臺(tái)式平板冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司Labfuge400r)全自動(dòng)核酸分離純化與加樣系統(tǒng)(德國(guó)Roche公司MagNA Pure LC 2.0)Eppendorf 9700 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Eppendorf公司)；EP-1019電泳儀(美國(guó)Embitec公司)； PrismTMABI3730XL型基因測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)；D-77WWL-20M凝膠成像儀(英國(guó)Syngene公司)。

1.2.2 尿素溶解實(shí)驗(yàn) 配制2 mol/L的尿素溶液，在96孔U型板中每孔依次加入2 mol/L尿素溶液100 μL，將標(biāo)本配制成2%～5%的紅細(xì)胞懸液，依次加入孔中，20 μL/孔，并與孔中尿素振蕩混勻，將96孔板放入臺(tái)式平板離心機(jī)離心560g×1 min，判讀結(jié)果，結(jié)果若發(fā)生溶血?jiǎng)t為陽性，反之為陰性[10]。

1.2.3 血型血清學(xué)檢測(cè) 使用常規(guī)血型血清學(xué)紅細(xì)胞抗原抗體凝集實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)樣本的Kidd血型表現(xiàn)型。

1.2.4Jk基因啟動(dòng)子及外顯子1～11的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[8]，引物序列見表1，擴(kuò)增的反應(yīng)條件，使用50 μL反應(yīng)體系：200 ng DNA，10 pmol引物，dNTP 200 μmol/L，1 U Taq酶(Promega)；擴(kuò)增程序：95℃ 10 min變性；96℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 Jk基因啟動(dòng)子及1～11外顯子擴(kuò)增及測(cè)序引物序列

1.2.5Jk基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序Jk基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序 經(jīng)Microcon-PCR純化柱，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并將純化后PCR產(chǎn)物，用ABI PRISM，BigDyeTMTerminator Cycle sequencing Ready Reaction kit，Eppendorf 9700 PCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行二次擴(kuò)增，隨后用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接及與參比序列比對(duì)分析，Jk基因參比序列為美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因庫NG_011775.3。

2 結(jié)果

2.1 尿素溶血試驗(yàn) 本研究中115例隨機(jī)取自無償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本，尿素溶血試驗(yàn)結(jié)果均呈陽性。7例Jk(a-b-)標(biāo)本在尿素溶液中未出現(xiàn)溶血，結(jié)果呈陰性。

2.2 血清學(xué)檢測(cè) 本研究中115例隨機(jī)取自無償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本，Kidd血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果：42例Jk(a+b+)、27例Jk(a+b-)、46例Jk(a-b+)。7例Jk(a-b-)標(biāo)本與抗-Jka、抗-Jkb反應(yīng)結(jié)果均呈陰性。

2.3Jk基因編碼區(qū)多態(tài)性分析方法的建立 以DNA為模板，應(yīng)用表1中10對(duì)引物，成功擴(kuò)增Jk基因啟動(dòng)子區(qū)域，Exon 1-3，編碼區(qū)Exon 4-5、Exon 6、Exon 7、Exon 8-9、Exon 10、Exon 11，及其側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中的電泳分析結(jié)果見圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷長(zhǎng)度依次為，Promoter=609 bp；exon 1=256 bp；exon 2=225 bp；exon 3=220 bp；exon 4-5=1 039 bp；exon 6=216 bp；exon 7=402 bp；exon 8-9=677 bp；exon 10=283 bp；exon 11=440 bp。

圖1 Jk基因啟動(dòng)子、外顯子1-11的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4 7例Jk(a-b-)的Jk基因測(cè)序分析 以SLC14A1基因(Jk基因)作為對(duì)照，比對(duì)7例Jk(a-b-)樣本的Jk基因序列，檢出2種Jk隱性基因，一種是位于第9外顯子的c. 896G>A (p. Gly299Glu)，另一種是IVS5-1g>a，內(nèi)含子5的3′端與第6外顯子拼接接受位點(diǎn)的堿基G突變?yōu)锳；同時(shí)在Jk基因非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的突變位點(diǎn)Intron 2 -51 c>t、Exon 3 42 c>a、Intron 3 72 c>t，測(cè)序電泳圖見圖2。

2.5 7例Jk(a-b-)與對(duì)照組的Jk基因多態(tài)性分析 7例Jk(a-b-)表型的Jk隱性基因，有2例是896G>A，5例是IVS5-1g>a。7例Jknull基因均攜帶Intron 2 -51 t/t與Exon 3 42 a/a純合子等位基因，檢出頻率為100%，在115例對(duì)照組標(biāo)本中29例攜帶Intron 2 -51 t/t與Exon 3 42 a/a純合子等位基因，檢出頻率為25.2%。另外7例Jknull基因第9外顯子c.838 A/A，均攜帶JkB基因，7例Jk(a-b-)與對(duì)照組115例標(biāo)本Jk基因均表現(xiàn)為Intron 3 72 t/t純合子基因型。見表2。

圖2 兩種Jk隱性基因及新突變等位基因測(cè)序電泳圖

表2 7例Jk(a-b-)與115例對(duì)照組Jk基因內(nèi)含子 2、3、8和外顯子3、6、9單核苷酸位點(diǎn)突變情況

3 討論

Jk(a-b-)表型可能存在2種不同的基因背景：(1)Jk基因位點(diǎn)隱性基因Jknull的純合；(2)推測(cè)非Jk基因位點(diǎn)上存在一個(gè)抑制基因Zn(Jk)抑制了JkA或JkB基因顯性表達(dá)。關(guān)于Jk無效的等位基因包括無義突變、錯(cuò)義突變、拼接位點(diǎn)的突變和堿基缺失，并且大多數(shù)突變氨基酸位于跨膜區(qū)。目前關(guān)于隱性基因國(guó)外已報(bào)道的有十余種不同的分子機(jī)制：(1)第4、5外顯子核苷酸1 603 bp的缺失；第4、5外顯子缺失，同時(shí)插入136 bp的片段。(2)IVS5-1g>a。(3)第5外顯子，c. 222C>A(p.Asn74Lys)[9]；c. 202C>T(p.Gln68stop)。(4)內(nèi)含子7的5′端拼接接受位點(diǎn)的堿基G突變?yōu)锳(IVS7+1g>a)，導(dǎo)致在mRNA的拼接成熟過程中外顯子7的缺失。(5)第7外顯子，c.561C>A(p.Tyr187stop)[8]；c.582C>G(p. Tyr194stop)；(6)第8外顯子，c.723delA(p. Ile262stop)，c.737T>G(Leu246Arg)[9]。(7)第9外顯子，c.871T>C(p.Ser291Pro)[11]；c.896G>A(p.Gly299Glu)[8]；(8)第10外顯子，c.956C>T(p.Thr319Met)[12]。本次研究發(fā)現(xiàn)7例Jk(a-b-)表型分子背景均為中國(guó)人群中常見的2個(gè)Jk隱性等位基因，一個(gè)是IVS5-1g>a，內(nèi)含子5的3′端拼接接受位點(diǎn)的堿基G突變?yōu)锳，導(dǎo)致在mRNA的拼接成熟過程中外顯子6的缺失；另一個(gè)是第9外顯子c.896G>A (p. Gly299Glu)。

Kidd血型系統(tǒng)主要有JkA和JkB一對(duì)等位基因決定，JkA和JkB以共顯性等位基因的方式進(jìn)行遺傳，G838A的置換是造成JkA和JkB多態(tài)性的主要原因。本次研究的7例Jk(a-b-)型的Jk等位基因第9外顯子均為c.838 A/A，表現(xiàn)為攜帶JkB基因型。據(jù)Irshaid報(bào)道[11]，他們?cè)诓ɡ嵛鱽喨思胺姨m人中發(fā)現(xiàn)的，第7外顯子的一個(gè)無義突變G588A與JkA/JkB多態(tài)性相關(guān)，但中國(guó)人群中G588A的堿基置換與JkA、JkB基因多態(tài)性無關(guān)[13]。

本次研究在Jk基因非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的突變位點(diǎn)Intron 2 -51 c>t、Exon 3 42 c>a、Intron 3 72 c>t，其中Intron 2 -51 t/t和Exon 3 42 a/a基因型在7例Jk(a-b-)樣本中的檢出頻率為100%，而在115例對(duì)照組標(biāo)本中檢出Intron 2 -51 t/t和Exon 3 42 a/a純合子基因型為25.2%，且均為Jk(a-b+)表型。從表2可以看出Intron 2 -51 t/t、Exon 3 42 a/a，Intron 2 -51 c/t、Exon 3 42 c/a，Intron 2 -51 c/c、Exon 3 42 c/c，總是連鎖出現(xiàn)，推測(cè)兩個(gè)新的純合子突變Intron 2 -51 c>t、Exon 3 42 c>a為連鎖遺傳，并且可能與Jk隱性基因相關(guān)。另外7例Jk(a-b-)和對(duì)照組115例標(biāo)本Jk基因均表現(xiàn)為Intron 3 72 t/t純合子基因型，懷疑該等位基因是否為中國(guó)人群Kidd血型基因的特有遺傳標(biāo)記。

對(duì)于Kidd血型系統(tǒng)抗原的鑒定血型血清學(xué)方法始終是最快速的檢測(cè)手段，但Kidd血型系統(tǒng)的特殊性，以及弱變異型的存在[14-15]，血型血清學(xué)凝集法對(duì)于Kidd血型抗原、抗體經(jīng)常不能被檢出，造成輸血前相容性實(shí)驗(yàn)的假陰性，臨床上很多交叉配血反應(yīng)性為陰性，輸血后紅細(xì)胞輸注無效或出現(xiàn)嚴(yán)重的輸血反應(yīng)，很大一部分原因是Kidd血型系統(tǒng)的抗原抗體誤判。因此目前對(duì)Jk基因的基因分型和序列分析[16-17]，以及國(guó)際上先進(jìn)的二代測(cè)序技術(shù)，質(zhì)譜分析技術(shù)的應(yīng)用[18-19]，可以更好地協(xié)助解決血型血清學(xué)檢測(cè)的疑難案例，揭示疑難Kidd血型的分子背景，進(jìn)一步保障了輸血的安全性。

[志謝：惠州市中心血站檢驗(yàn)科嚴(yán)鳳好副主任技師為本研究提供了5例Jk(a-b-)標(biāo)本，特此感謝!]