芽孢桿菌種間原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)Surfactin新菌株

潘旭耀 魏韜 譚柱豪 林龍鎮(zhèn) 郭麗瓊 林俊芳

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣州 510640；2. 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心， 廣州 510640）

表面活性素（Surfactin）是芽孢桿菌經(jīng)過非核糖體途徑合成的次級代謝產(chǎn)物，由7個氨基酸肽鏈和一個脂肪酸構(gòu)成［1］，是目前報道的最有效的脂肽類生物表面活性劑［2］。此外，由于Surfactin還具有高效抑菌、抗腫瘤和抗病毒等［3］生物活性以及穩(wěn)定性好、生物相容性好、易被自然降解等優(yōu)良的理化性質(zhì)［4］，因而在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、畜牧、環(huán)保等眾多領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景［5］。

然而，由于天然野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)Surfactin的能力極低（一般不超過600 mg/L）［6］，導(dǎo)致其工業(yè)化生產(chǎn)成本高，進(jìn)而嚴(yán)重阻礙了Surfactin的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用［7］。目前，關(guān)于野生型菌株的育種手段主要有誘變育種、原生質(zhì)體融合育種和基因工程育種。隨機誘變育種由于突變的不定向性，導(dǎo)致篩選工作量大，改造成功率低。而基因工程雖可對基因組的任一靶點實現(xiàn)精準(zhǔn)編輯，但由于表面活性素的生物合成過程所涉及的調(diào)控靶點眾多且不完全清晰［8］，因此通過單一基因的改造往往無法有效提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，難以獲得滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的工程菌。原生質(zhì)體融合作為一種傳統(tǒng)的育種手段能夠有效地將兩親本的優(yōu)良性狀結(jié)合到一起，有望獲得高產(chǎn)Surfactin的優(yōu)良融合菌株。目前，原生質(zhì)體融合在育種方面已取得了很大的成就。例如，姜雄韜等［9］通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了產(chǎn)細(xì)菌素能力強的融合菌株。Sun等［10］通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了能在高溫條件下產(chǎn)胞外多糖的融合菌株。因此，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)定向重組芽孢桿菌種間優(yōu)良遺傳特性，以獲得Surfactin合成能力更強的優(yōu)良融合菌株，已成為一種重要的研究手段。

暹羅芽孢桿菌為本實驗室自己分離的菌株，具有廣譜抗菌的效果，能產(chǎn)生Surfactin，且其發(fā)酵液的抗菌性質(zhì)穩(wěn)定［11］。而納豆芽孢桿菌作為一種納豆發(fā)酵菌，不僅能產(chǎn)生易被人體吸收的氨基酸、有機酸、寡聚糖等營養(yǎng)成分，還能產(chǎn)生Surfactin［12-13］。因此，本研究擬通過對納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，以期獲得產(chǎn)Surfactin能力更強，且性能優(yōu)異的融合菌株，為Surfactin的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用夯實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：納豆芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌保藏于廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心。主要試劑：SMM（蔗糖0.5 mol/L、MgCl220 mmol/L和順丁烯二酸 20 mmol/L，pH 6.5）115℃，高壓蒸汽滅菌20 min。10 mg/mL溶菌酶母液：稱取0.1 g溶菌酶定容至10 mL，過濾除菌。PEG：稱取5 g PEG6000定容至 10 mL，pH 9.0。

再生培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，牛肉膏 0.5%，NaCl 0.5%，MgCl24.01 g/L， 甘 露 醇 0.3 mol/L，pH 7.2，121℃，高壓蒸汽滅菌30 min。

Landy發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，L-谷氨酸5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，酵母粉 1，L-苯丙氨酸 2×10-3，MnSO45×10-3，CuSO4·5H2O 0.16×10-3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15×10-3，pH 7.0，115℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH7.4，121℃，高壓蒸汽滅菌30 min。

CPC-BTB溶 液：0.1 mol/L PBS（Na2HPO4/NaH2PO4，pH8.0），0.2 mmol/L CPC（氯代十六烷基吡啶）和0.2 mmol/L BTB（溴百里酚藍(lán)）用PBS溶解，取等量的CPC、BTB溶液混合即為CPC-BTB溶液。

Surfactin標(biāo)品購置于Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備

1.2.1.1 最適酶濃度篩選 將兩菌株按1%的接種量二次接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件培養(yǎng)至對數(shù)中期，收集10 mL菌液，用無菌水洗滌菌體2次，最后用SMM溶液調(diào)整菌體濃度為1×107CFU/mL。加入不同濃度的溶菌酶，37℃酶解30 min，酶解完成后立即洗滌菌體2次。分別用無菌水和SMM溶液稀釋菌液至10-5，靜置30 min后取0.1 mL菌液涂布于再生培養(yǎng)基。

1.2.1.2 最佳酶解時間篩選 同上述方法調(diào)整兩親本菌株的濃度至1×107CFU/mL，在最佳酶解濃度條件下，分別設(shè)置不同的酶解時間來探究時間對親本菌株原生質(zhì)體形成的影響。將酶解完成后的菌液立即離心、洗滌菌體2次。分別用無菌水和SMM溶液稀釋菌液至10-5，靜置30 min后取0.1 mL菌液涂布于再生培養(yǎng)基。

原生質(zhì)體的形成率和再生率計算：

原生質(zhì)體形成率=（A-B）/A×100%

再生率=（C-B）/（A-B）×100%

其中，A：溶菌酶處理前再生平板上的菌落數(shù)；B：溶菌酶處理后未原生質(zhì)體化的菌落數(shù)；C：溶菌酶處理后再生平板上的菌落數(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體的滅活標(biāo)記 分別采用紫外滅活和熱滅活兩種方式對親本菌株進(jìn)行滅活標(biāo)記，不同的滅活方式對親本菌株損傷的生理部位不同，紫外滅活主要作用在DNA上使原生質(zhì)體失活，而熱滅活主要作用在細(xì)胞質(zhì)中的一些蛋白酶上，使其達(dá)到失活的效果。當(dāng)兩原生質(zhì)體發(fā)生融合，它們在生理性狀上達(dá)到互補，從而能夠在再生培養(yǎng)基上再生出來。

1.2.2.1 納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體紫外滅活 在最佳酶濃度、最佳的酶解時間下制得納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體溶液。取3 mL原生質(zhì)體菌液放置于6 cm的平板中在15 w的紫外燈下照射不同時間，取0.1 mL菌液涂布于再生培養(yǎng)基，觀察其滅活效果。

1.2.2.2 暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體熱滅活 在最佳酶濃度、最佳的酶解時間下制得暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體溶液。取3 mL原生質(zhì)體菌液于試管中，放置于85℃的水浴鍋中進(jìn)行不同時間的滅活處理，取0.1 mL菌液涂布于再生培養(yǎng)基，觀察其滅活效果。

1.2.3 原生質(zhì)體融合 取等量的滅活兩親株混合5 min，4 000 r/min離心15 min收集菌體，向沉淀中加入0.2 mL的CaCl2溶液，并用移液槍輕輕吹打充分溶解菌體。再緩慢向溶液中加入50%的PEG6000 1.8 mL，充分混勻菌體，放置于38℃的水浴鍋中15 min。融合完成后，立即加入5倍體積的SMM溶液進(jìn)行稀釋，離心、洗滌菌體2次。最后取0.1 mL菌液涂布于再生培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.2.4 融合子的鑒定 參考Nishito等［14］文獻(xiàn)，對納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌中的SP片段和IT片段進(jìn)行擴增，兩個片段分別只能在一株親本菌株中擴增出來，而無法在另一株親本菌株中擴增。通過設(shè)計引物對Sp-F（5'-ATGAAGTTTACGGAATTTA-3'）、Sp-R（5'-TTATAAAAGCTCTTCGTA CG-3'）和 IT-F（CAACGGTATCGAAGCA）、IT-R（CGTCTCGGGTATCATTT）來鑒定菌株的陽性融合子，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 10 min，變性94℃ 35 s，48℃ 35 s，72℃ 40 s，30 個循環(huán)，72℃10 min，4℃ forever。最后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 高產(chǎn)Surfactin菌株的篩選 高產(chǎn)Surfactin菌株的高通量篩選，采用本實驗室在Yang等［6］文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上改良和優(yōu)化的BTB-CPC法（另文報道），通過BTB-CPC溶液與脂肽Surfactin發(fā)生的顯色反應(yīng)可以快速檢測發(fā)酵液中脂肽Surfactin的含量。其反應(yīng)原理為Surfactin與CPC-BTB反應(yīng)可以將BTB置換出來，從而發(fā)生顏色變化，然后在615 nm的波長下測定其吸光度來確定Surfactin的含量。先配制CPC-BTB溶液，靜置2 h使溶液達(dá)到穩(wěn)定，再取160 μL的CPC-BTB溶液，放入96孔板中，在加入20 μL的發(fā)酵上清液，在室溫條件下反應(yīng)5 min，最后在615 nm的波長下測定其吸光度，根據(jù)吸光度的大小來初篩高產(chǎn)Surfactin菌株。

1.2.6 融合菌株Surfactin的提取 通過酸沉淀甲醇抽提法［15］來提取Surfactin，將初篩菌株按1%的接種量接種于Landy培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，再將發(fā)酵液經(jīng)過4℃，8 000 r/min離心，收集上清，調(diào)其pH值到2.0，放置于4℃的冰箱靜置過夜沉淀，8 000 r/min離心收集沉淀，再將沉淀用pH為2.0的蒸餾水洗滌2次后冷凍干燥，凍干粉用甲醇抽提兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用甲醇定容至10 mL備用。

1.2.7 融合菌株 Surfactin的液相檢測 取上述提取的脂肽溶液經(jīng)過HPLC確定其Surfactin的含量。Surfactin色譜條件：色譜柱Ultimate? AQ-C18（5.0 μm，4.6×250 mm）；紫外檢測波長，205 nm；柱溫，25℃；流動相：甲醇/水（含1‰三氟乙酸）=90∶10；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。經(jīng)過液相檢測其Surfactin有4個峰，通過計算4個峰面積總和來計算Surfactin的濃度。

1.2.8 融合菌株的電鏡觀察 以1%的接種量接種親本菌株和F8菌株于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取2 mL菌液用PBS溶液離心（5 000 r/min，5min）洗滌4次，用2%的戊二醛溶液4℃處理過夜，再用PBS洗滌4次，每次10 min。用1%的餓酸溶液固定樣品3 h，小心去除餓酸廢液，再用PBS洗滌3次，每次10 min。然后分別用30%、50%、70%、80%和90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇處理樣品，每次10 min，最后用100%的乙醇處理2次。樣品處理完后放置于粘樣臺上，進(jìn)行離子噴鍍，掃描電鏡觀察。

1.2.9 融合菌株的穩(wěn)定性分析 將融合菌株接種至LB培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)5代，再通過PCR擴增其中的Sp和It片段，檢測其融合子是否穩(wěn)定。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 表中的所以數(shù)據(jù)分析均采用Origin軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 親本菌株的原生質(zhì)體制備

2.1.1 納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體制備的最適酶濃度篩選 由于不同的芽孢桿菌對酶的敏感程度不同，制備原生質(zhì)體所需的酶濃度也不一樣。從表1中可以看出，納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體的形成率隨著酶濃度的增加而增加，但再生率總體上隨著酶濃度的增加而降低。綜合原生質(zhì)體的形成率和再生率結(jié)果，得出納豆芽孢桿菌的最佳酶濃度為0.25 mg/mL，暹羅芽孢桿菌的最佳酶濃度為0.2 mg/mL。

表1 不同酶濃度對親本菌株原生質(zhì)體形成的影響

2.1.2 納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體制備的最佳酶解時間 在一定的酶濃度下，原生質(zhì)體形成率隨時間的增加而增加，但如果酶解時間過長，最后對原生質(zhì)體的再生會產(chǎn)生很大負(fù)面影響。

表2為納豆芽孢桿菌在酶解濃度為0.25 mg/mL、暹羅芽孢桿菌酶濃度為0.2 mg/mL時，原生質(zhì)體的形成率和再生率結(jié)果。從表2可以看出，綜合原生質(zhì)體的形成率和再生率指標(biāo)，納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌最佳酶解的時間分別為25 min和20 min。

表2 不同時間對親本菌株原生質(zhì)體形成的影響

2.2 納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體的滅活標(biāo)記

對于沒有標(biāo)記特性的菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，滅活標(biāo)記是一種常用的標(biāo)記方法。將納豆芽孢桿菌進(jìn)行紫外滅活結(jié)果見圖1。圖1顯示在滅活時間為40 min時納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體大部分已經(jīng)失活，但將原液涂布于再生培養(yǎng)基上，再生培養(yǎng)基上有很多的菌株長出，延長滅活時間為80 min時，平板上沒有菌落長出，所以最后確定紫外滅活時間為80 min可達(dá)到100%滅活。而暹羅芽孢桿菌的原生質(zhì)體在85℃的條件下滅活40 min后，經(jīng)過涂布再生平板檢測沒有菌落長出，故確定暹羅芽孢桿菌的原生質(zhì)體的滅活條件為在85℃的條件下滅活40 min。

2.3 納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌的原生質(zhì)體融合

對于滅活標(biāo)記后的原生質(zhì)體，無法單獨在培養(yǎng)基中生長，當(dāng)其融合后才能在培養(yǎng)基中長出。按上述的融合方法進(jìn)行納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌的原生質(zhì)體融合后，涂布到再生平板上在37℃培養(yǎng)24 h，從再生平板上長出的菌落認(rèn)定為擬融合子。其結(jié)果如圖2，兩親本的對照組無菌落長出，說明菌株滅活標(biāo)記完全，而再生平板上有菌落長出，說明菌株發(fā)生了融合。

圖1 親本菌株原生質(zhì)體的滅活標(biāo)記

圖2 原生質(zhì)體融合結(jié)果

2.4 融合子的鑒定

采取多重PCR的方法來鑒定兩親本菌株的陽性融合子。根據(jù)PCR結(jié)果（圖3）可知，在再生平板上長出的菌株大部分能擴增出兩條單一條帶，而在單個親本菌株中分別只能擴增出一條帶，說明兩親本菌株發(fā)生了融合。挑出陽性融合子做進(jìn)一步的高產(chǎn)Surfactin的篩選。

圖3 擬融合子菌株的PCR鑒定

2.5 高產(chǎn)Surfactin融合菌株的篩選

挑取PCR鑒定為陽性的再生平板上融合菌株于48孔板中發(fā)酵48 h，取等量菌體發(fā)酵液離心，將CPC-BTB溶液與發(fā)酵上清液反應(yīng)。結(jié)果（圖4）表明，在篩選的215株菌株中，大部分菌株反應(yīng)后的吸光度在615 nm下的吸光度要比原始親株低，只有少數(shù)的融合菌株反應(yīng)后的吸光度要高，其部分結(jié)果見表3。將吸光度較親本菌株高的融合菌株進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩，再通過HPLC檢驗，最終選出目的菌株。

圖4 高產(chǎn)Surfactin融合菌株的初篩

2.6 高產(chǎn)融合菌株的液相檢測

通過酸沉淀甲醇抽提的方法提取發(fā)酵液中的脂肽物質(zhì)，根據(jù)不同的Surfactin標(biāo)準(zhǔn)溶液在205nm處吸收峰峰面積繪制Surfactin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積之間的關(guān)系為：y=2×107x+7×106，R2=0.951 9。用同樣的方法測定發(fā)酵液中Surfactin的含量，如表4所示。

表3 部分初篩顯色反應(yīng)篩選結(jié)果

表4 融合菌株與親本菌株的Surfactin含量比較

圖5為Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品的液相圖，確定其Surfactin4個峰的出峰時間。納豆芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和融合菌株F8的Surfactin含量的液相比對如圖6，其Surfactin主要是1#峰和3#峰的兩個同系物增加，而其余Surfactin的兩個同系物無明顯變化。

2.7 融合菌株的電鏡形態(tài)觀察

通過電鏡掃描觀察（圖7）發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌及融合菌株F8在放大5萬倍后，其形態(tài)上都為桿狀，菌體直徑無明顯變化。而融合后的菌株F8在菌體長度上相對于兩親本菌株都有所加長，說明融合后的菌株在形態(tài)上發(fā)生了變化。

2.8 穩(wěn)定性分析

原生質(zhì)體融合育種過程中，融合菌株經(jīng)過多次傳代后容易發(fā)生退化，導(dǎo)致菌株又恢復(fù)到以前的狀態(tài)。在對融合菌株F8進(jìn)行5代的傳代后繼續(xù)擴增其中的Sp和It片段，驗證融合菌株是否穩(wěn)定，PCR結(jié)果如圖8，可以看出2條帶存在于融合菌株F8中，說明融合子F8穩(wěn)定。

3 討論

圖 5 Surfactin 標(biāo)品圖（1#、2#、3#、4#為Surfactin峰）

圖6 融合菌株與親本菌株的Surfactin液相比對圖

圖7 融合菌株和親本的電鏡掃描（左5萬倍，右3萬倍）

圖8 融合菌株F8 Sp和It片段的PCR擴增

Surfactin作為一種極具應(yīng)用前景的物質(zhì)，受到了科學(xué)家們的廣泛青睞，而解決當(dāng)前野生型菌株產(chǎn)Surfactin的能力低也是研究的重點問題。原生質(zhì)體融合作為一種傳統(tǒng)的育種技術(shù)，其優(yōu)點是可以結(jié)合兩親本菌株的優(yōu)良性狀，并且操作簡單、方便［16］。本研究中通過將兩株產(chǎn)Surfactin能力都不強的親本菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得了產(chǎn)Surfactin能力強的融合新菌株。其原因可能是原生質(zhì)體發(fā)生融合后，兩菌株的基因組發(fā)生插入、交換等一系列的重組變化后，使菌株產(chǎn)Surfactin的能力得到了提高。對于高產(chǎn)Surfactin菌株的篩選，主要的問題是如何快速的篩選出目的菌株。在以前的研究中，Surfactin高產(chǎn)菌株的篩選主要還是集中在離子對平板法、瓊脂柱法、瓊脂擴散法、血平板法和藍(lán)色凝膠平板法等［17-18］，本實驗對部分方法進(jìn)行了嘗試發(fā)現(xiàn)，瓊脂柱法和血平板法都不能夠準(zhǔn)確的篩選出目的菌株，可能原因是芽孢桿菌能夠產(chǎn)生很多和Surfactin性質(zhì)相近的物質(zhì)，如抗菌蛋白、糖脂等。這些都將會對篩選結(jié)果產(chǎn)生很大的干擾，導(dǎo)致篩選誤差增大［19-20］。參考Yang等［6］關(guān)于Surfactin顯色反應(yīng)的篩選方法，本實驗室在該方法的基礎(chǔ)上改良和優(yōu)化了CPCBTB法（另文報道），能夠快速對高產(chǎn)Surfactin菌株進(jìn)行初篩。該方法相比于其它的一些Surfactin篩選方法，能夠通過吸光度的測定快速篩選出我們的目的菌株，大量節(jié)約了篩選時間和工作量。對于最終篩選得到的融合菌株F8，經(jīng)過HPLC驗證，其產(chǎn)Surfactin能力得到了提高，說明該方法能夠有效地對高產(chǎn)Surfactin菌株進(jìn)行篩選。

本研究通過多重PCR技術(shù)來鑒定融合子，相比于以前通過RFLP標(biāo)記技術(shù)、SSR標(biāo)記技術(shù)、AFLP標(biāo)記技術(shù)和其他一些鑒定技術(shù)［21］，該方法更為簡單、方便。之前研究在做原生質(zhì)體融合時，先篩選出所需的目的菌株，然后對目的菌株進(jìn)行融合子鑒定，這樣浪費時間，因為原生質(zhì)體之間自己本身也會發(fā)生融合，導(dǎo)致在進(jìn)行目的菌株篩選時要篩選更多的菌株。而通過雙重PCR技術(shù)確定是融合子后再進(jìn)一步的篩選將節(jié)省大量的時間。

另外，在研究中發(fā)現(xiàn)融合菌株不穩(wěn)定，經(jīng)過幾次傳代之后菌株的融合性狀消失，PCR擴增差異片段消失。本研究中的融合子F8經(jīng)過5次以上傳代后還能擴增出兩條差異片段，說明該融合子已經(jīng)穩(wěn)定，其他7株沒有擴增出特異差異片段，說明融合性狀丟失。F8融合菌株的電鏡形狀觀察也表明融合菌株在形態(tài)上長度變長了，這進(jìn)一步證明了F8是融合了親本的基因組，至于基因組是如何變化的，本團(tuán)隊將進(jìn)一步進(jìn)行融合子的全基因測序。

4 結(jié)論

原生質(zhì)體融合技術(shù)可以提高野生型菌株產(chǎn)Surfactin的能力。對原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行酶濃度和酶解時間優(yōu)化，最適合納豆芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌原生質(zhì)體制備的酶濃度分別為0.25 mg/mL和0.2 mg/mL，最佳的酶解時間為25 min和20 min。最后使得其原生質(zhì)體形成率分別為83.1%和84.3%。再經(jīng)過PEG6000促使原生質(zhì)體發(fā)生融合，融合條件為50%的PEG6000在38℃下融合時間15 min，并利用PCR融合子鑒定和Surfactin高通量篩選技術(shù)，最后從215株融合菌株中篩選出一株F8菌株，其產(chǎn)Surfactin能力相較于納豆芽孢桿菌提高了33.3%，暹羅芽孢桿菌提高了60%，通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn)融合菌株F8的形態(tài)相對于親本菌株都有所加長，并且融合菌株F8能穩(wěn)定遺傳。