基于三種碳源篩選低溫纖維素降解菌及其復合系的降解能力分析

孟建宇 冀錦華 賈麗娟 郭慧琴 陶羽 馮福應

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院應用與環(huán)境微生物研究所，呼和浩特 010011）

植物性纖維素和半纖維素是地球上最豐富的可再生資源，其年產(chǎn)量分別可達720和600 億t［1］，我國每年的纖維素廢棄物亦達20 億t［2］。如何實現(xiàn)纖維素的高效生物轉(zhuǎn)化是最充分利用纖維素資源的關(guān)鍵［3］。在低溫環(huán)境中，中高溫菌株的纖維素降解活性會大大降低，而低溫菌株的纖維素酶具有特殊的分子適應機制，在連續(xù)運轉(zhuǎn)系統(tǒng)中具有高生長速率、高酶活力及高催化效率，而且反應過程在低溫下進行，無需加熱和冷卻，具有比中高溫纖維素酶的處理時間短、生產(chǎn)成本低、更加節(jié)約能源的優(yōu)點，使其在低溫環(huán)境生物質(zhì)降解上有極大的應用潛力［4-6］，因此尋找和開發(fā)產(chǎn)高活性低溫纖維素酶菌種成為當前研究的熱點［7］。

以單一的碳源為底物分離獲得的菌株普遍存在菌種較單一且纖維素降解率較低等特點，而且多數(shù)不能產(chǎn)生全組分的纖維素酶，往往需要多種微生物共同協(xié)作完成，因此，復合菌系的作用日顯突出［8-9］。針對地區(qū)氣候、基于多種碳源為底物進行分離培養(yǎng)，可得到產(chǎn)不同組分的纖維素酶，并且以酶活較高的菌株構(gòu)建復合系，有望獲得適應地區(qū)氣候的、纖維素降解效率較高的菌株或復合系。但現(xiàn)有研究主要針對中高溫纖維素降解菌群，而對低溫纖維素降解菌系的研究相對較少，已分離到的產(chǎn)低溫纖維素酶的微生物種類也有限［10-12］。

由于內(nèi)蒙古地區(qū)秋冬季氣溫低，周期長，中高溫菌及其酶的應用受到了較大限制，因此，加強低溫纖維素降解菌及其酶的研究對于低溫地區(qū)纖維素等生物質(zhì)資源的降解應用具有重要意義［13-14］。本文分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素和D-水楊苷3種碳源篩選具有外切葡聚糖酶酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶酶活性和β-葡萄糖苷酶酶活性的菌株并構(gòu)建高效低溫纖維素降解復合系，分析研究低溫地區(qū)土壤纖維素降解菌的群落結(jié)構(gòu)，認識和挖掘該地區(qū)低溫纖維素降解菌資源，篩選高效的低溫纖維素降解菌群，將為開發(fā)低溫降解纖維素復合菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 樣品為采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾森林的帶腐爛落葉的表層土壤，放冰盒運回實驗室，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑配方

（1）富集培養(yǎng)基：纖維素（秸稈末、濾紙漿）5 g，蛋白胨 5 g，碳酸鈣 2 g，氯化鈉 5 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

（2）篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷 5 g，酵母粉 2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

（3）鑒別培養(yǎng)基：硫酸銨 2 g，硫酸鎂 0.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，氯化鈉 0.5 g，羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷 2 g，剛果紅 0.4 g，瓊脂 22 g，蒸餾水 1 000 mL。

（4）濾紙培養(yǎng)基：濾紙條（每條：1 cm×3.6 cm，約0.03 g）5 g，酵母粉 2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

（5）1% CMC-Na/微晶纖維素/D-水楊苷溶液：10 g CMC-Na/微晶纖維素/D-水楊苷溶解于檸檬酸緩沖液（pH 4.8，0.2 mol/L）并定容至1 000 mL。

（6）10×TE緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8。高溫滅菌，室溫保存，用時稀釋為1×TE。

1.2 方法

1.2.1 土樣富集培養(yǎng) 將采回的土樣充分混合均勻，取適當樣品于燒杯中，加入富集培養(yǎng)基，充分混勻，置于4℃培養(yǎng)箱中進行富集，15 d后，轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3 次后，用于分離和篩選纖維素降解菌。

1.2.2 菌株篩選 取10 mL富集好的樣品溶液加入含90 mL無菌水的三角瓶中，置于 120 r/min搖床中4℃振蕩1 h，充分混勻，然后將菌懸液稀釋成10-2、10-3、10-43個濃度梯度，每個梯度3個重復，涂布到3種含不同碳源的固體培養(yǎng)基上，4℃培養(yǎng)1-2周。挑取不同形態(tài)、顏色的菌落進行劃線純化，獲得純培養(yǎng)物。挑取可降解不同纖維素的菌株，接種到對應的碳源-剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，4℃培養(yǎng)，進一步篩選，觀察菌株生長狀況。根據(jù)水解圈的大小篩選纖維素酶活性高的菌株。

1.2.3 菌株的鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 參考胡曉紅等［15］的方法進行細菌DNA的提取。選用細菌通用引物對27F和1492R進行PCR擴增。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（上海捷銳生物工程有限公司）將PCR擴增產(chǎn)物進行純化。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-T1 Cloning Kit將目的片段與載體連接，并將其連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。用M13引物對陽性克隆子進行菌落PCR擴增檢測，由上海生物工程有限公司進行測序。將測序結(jié)果中的載體序列刪除，然后選取峰圖整齊的序列利用EzTaxon數(shù)據(jù)庫對各個核酸序列進行比對及相似性分析。

1.2.4 酶活性測定 以150 μL 1%（W/V）的微晶纖維素/CMC-Na /D-水楊苷緩沖液、醋酸緩沖液（含0.0015 g濾紙）分別作為反應底物，加入50 μL粗酶液，于50℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入200 μL DNS終止反應，并將混合物在沸水浴中煮5 min，待反應混合物冷卻，加入650 μL蒸餾水，混勻，取出200 μL加至96孔酶標板上，用酶標儀測定540 nm下的吸光值（OD540）。分別測定外切葡聚糖酶酶活、內(nèi)切葡聚糖纖維二糖水解酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和總酶活（濾紙酶活）。

酶活力定義：在50℃的反應條件下，1 min內(nèi)催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 U/mL。

1.2.5 低溫細菌降解復合系構(gòu)建 從分離純化得到的經(jīng)拮抗實驗驗證的互不拮抗菌株中，對應每種纖維素碳源分別篩選出3 株酶活性較高的菌株，共9株，進行復合系構(gòu)建。

1.2.5.1 單菌株的濾紙酶活性測定 把互不拮抗的菌株單獨接種到濾紙培養(yǎng)基中，4℃振蕩培養(yǎng)，每隔24 h檢測一次發(fā)酵液的OD540值，測定濾紙酶活。

1.2.5.2 降解復合系的構(gòu)建及其酶活性測定 把互不拮抗的菌株接種到對應碳源的液體培養(yǎng)基中，4℃恒溫振蕩培養(yǎng)，當OD600均接近時，在3種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株當中任意選擇一株菌組合成復合系。各取1 mL復合系培養(yǎng)液分別接種到50 mL已滅菌的濾紙培養(yǎng)基中，4℃低溫培養(yǎng)，每隔24 h測定一次發(fā)酵液的濾紙酶活及培養(yǎng)液的pH值。

1.2.5.3 降解復合系的濾紙降解率 將烘干至恒重的濾紙加入到降解復合系培養(yǎng)基中，4℃低溫培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液于5 400 r/min離心6 min，去除上清液后水洗，于6 000 r/min離心6 min，再用鹽酸和硝酸的混合溶液洗除菌體后，用清水洗滌，105℃烘干至恒重，稱重，計算失重率，每組3個平行［16］。

2 結(jié)果

2.1 低溫纖維素降解細菌的分離篩選

用3種含不同碳源的鑒別培養(yǎng)基分離篩選土樣中低溫纖維素降解菌，共得到172 株細菌。細菌菌落主要以淺黃色、白色、淺紅色、黃色、橘紅色為主，多為圓形或近圓形的凸起的菌落，且多數(shù)邊緣光滑，光澤不透明；無規(guī)則的菌落很少，且只有少數(shù)菌落邊緣粗糙，扁平的菌落較少。

2.2 不同碳源篩選的低溫纖維素菌群結(jié)構(gòu)分析

將篩選菌株的16S rDNA序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行同源性分析，對低溫纖維素降解菌群進行分類。在172 株低溫纖維素降解細菌中，可以利用微晶纖維素（Avicel）的細菌有46 株（圖1-2），在綱分類水平上，25 株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria），占全部菌株的54%，為最優(yōu)勢類群，其次為α-變形菌綱（α-Proteobacteria），占28%；在屬分類水平上，有16 株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），占35%，為降解微晶纖維素的最優(yōu)勢菌屬，7 株屬于根瘤菌屬（Rhizobium），占15%，為第二優(yōu)勢菌屬。

圖1 以微晶纖維素為碳源篩選的低溫細菌群落組成（綱水平）

能利用羧甲基纖維素（CMC）的細菌有65株（圖3-4）。在綱分類水平上，17 株屬于變形菌門中的α-變形菌綱（α-Proteobacteria），占全部菌株的26%；31 株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria），占全部菌株的48%，為最優(yōu)勢類群，其次為 α-變形菌綱（α-Proteobacteria），占26%；在屬分類水平上，有17 株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），占26%，為降解CMC的最優(yōu)勢菌屬，8 株屬于根瘤菌屬（Rhizobium），8 株屬于厄氏菌屬（Oerskovia），分別占12%，為第二優(yōu)勢菌屬。

圖2 以微晶纖維素為碳源篩選的低溫細菌群落組成（屬水平）

圖3 以羧甲基纖維素為碳源篩選的低溫細菌群落組成（綱水平）

圖4 以羧甲基纖維素為碳源篩選的低溫細菌群落組成（屬水平）

可以利用D-水楊苷的細菌有61 株（圖5-6），在綱分類水平上，33株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria），占54%，為最優(yōu)勢類群， 其 次 為 α-變 形 菌 綱（α-Proteobacteria）， 占34%；在屬分類水平上，有16 株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），占26%，為降解D-水楊苷的最優(yōu)勢菌屬，有10 株屬于根瘤菌屬（Rhizobium），占16%，為第二優(yōu)勢菌屬。

圖5 以D-水楊苷為碳源篩選的低溫細菌群落組成（綱水平）

圖6 以D-水楊苷為碳源篩選的低溫細菌群落組成（屬水平）

γ-變形菌綱為第一優(yōu)勢菌群，α-變形菌綱為第二優(yōu)勢菌群，可以低溫降解纖維素的數(shù)量最少的菌群為厚壁菌門（Firmicutes）。

2.3 低溫纖維素降解菌的酶活測定

對篩選得到的172 株低溫纖維素降解菌在4℃下進行其相對酶活的測定，將其中酶活性相對較高的前10 株菌列于表1。其中，以微晶纖維素為碳源篩得的菌株的酶活性均在7 U/mL-17 U/mL；菌株4DXC66、4DXC33和4DXC15的CMC酶活性均低于10 U/mL，菌株4DXC64的CMC酶活性為31.11 U/mL，最高，其余菌株的CMC酶活性均在10 U/mL-20 U/mL；菌株4DXD98和4DXD101的β-葡萄糖苷酶活性相對較高，分別為17.64 U/mL和16.5 U/mL，其余菌株的酶活性均在9 U/mL-15 U/mL。

表1 三種不同碳源篩選的低溫纖維素降解菌的酶活性

2.4 低溫纖維素降解復合系的構(gòu)建及其降解濾紙能力

從對應每種纖維素碳源分別篩選出3 株酶活性較高的菌株，然后組合成27 個復合系。降解微晶纖維素能力較強的菌株為4DXA13、4DXA23和4DXA41，分別編號為1、2、3；降解CMC能力較強的菌株為4DXC19、4DXC32和4DXC64，分別編號為1'、2'、3'；降解D-水楊苷能力較強的菌株為4DXD98、4DXD101和 4DXD114，分別編號為 1''、2''、3''。9 株菌經(jīng)測序得到其16S rDNA序列，經(jīng)過EzTaxon數(shù)據(jù)庫比對，與最近緣模式種的同源性均大于99%（表2）。其中，菌株4DXA41、4DXC19、4DXC64、4DXD101和4DXD114均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），4DXA13 屬 于Ancylobacter，4DXA23屬于葉桿菌屬（Phyllobacterium），4DXC32屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），4DXD98屬于Lelliottia。

2.4.1 降解復合系所用單菌株在濾紙培養(yǎng)基中的酶活 將構(gòu)建低溫降解復合系所用的單菌株分別接種到濾紙液體培養(yǎng)基中4℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定一次酶活性，結(jié)果如圖7所示。降解微晶纖維素的菌株 4DXA13、4DXA23、4DXA41和降解 D-水楊苷的菌株4DXD98、4DXD101、4DXD114的濾紙酶活性都在第4天達到最大，分別為17.46 U/mL、13.62 U/mL、13.79 U/mL、15.87 U/mL、15.68 U/mL、17.26 U/mL；而 降 解 CMC的 菌 株 4DXC19、4DXC32、4DXC64的濾紙酶活性在第5天達到最大，分別為26.05 U/mL、25.86 U/mL、32.74 U/mL。

2.4.2 降解復合系的濾紙酶活及降解穩(wěn)定性 把27個降解復合系組合分別接種到濾紙液體培養(yǎng)基中4℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h對各個組合的濾紙酶活性進行測定，結(jié)果如圖8所示。低溫降解復合系在發(fā)酵的過程中，約17個組合的濾紙酶活性出現(xiàn)了兩個峰值，剩余組合的酶活性只出現(xiàn)一個峰值。其中，組 合 D11'1''、D11'2''、D12'1''、D12'2''、D12'3''、D21'2''、D23'1''、D31'1''、D32'2''、D33'1'' 在 第 4天和在第6 天出現(xiàn)二個峰值；組合D13'1''、D21'1''、D21'3''、D23'3''、D31'2''、D32'1''、D33'2'' 在 第 3天和第5 天出現(xiàn)二個峰值；而組合D11'3''、D13'2''、D13'3''、D22'2''、D22'3''、D23'2''、D31'3''、D32'3''、D33'3''只在第5 天出現(xiàn)一個峰值；D22'1''只在第4 天出現(xiàn)一個峰值。

降解復合系中酶活性比較高的組合是D12'1''、D12'2''、D13'1''、D13'2''、D21'2''、D23'2''、D31'1''、D31'2''和 D32'2''，酶活性都在 147-160 U/mL之間，其中組合D13'1''和D13'2''的酶活性最高，為158.02 U/mL，是復合系中單菌株的5-10 倍，4℃下濾紙降解率分別為17.6%和18.8%（圖9），為低溫降解濾紙的最優(yōu)菌群組合。

表2 低溫降解復合系所用菌株的序列同源性

圖7 4℃下構(gòu)建低溫降解復合系的單菌株的濾紙酶活性

未調(diào)pH的培養(yǎng)液滅菌后的pH為8.11和8.23，接種復合系D13'1''和D13'2培養(yǎng)1 d后兩者的pH值分別下降到6.32和6.43，并在隨后5 d里都維持在6.2-6.6之間，變化幅度較小，比較穩(wěn)定（圖 10）。

3 討論

本文分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素和D-水楊苷為唯一碳源共篩選得到172 株低溫纖維素降解菌。其中，γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）為第一優(yōu)勢菌群，α-變形菌綱（α-Proteobacteria）為第二優(yōu)勢菌群，在所有低溫降解纖維素細菌中占絕對數(shù)量優(yōu)勢，為主要菌群，其次為Actinobacteria綱。在低溫降解D-水楊苷中出現(xiàn)擬桿菌門（Bacteroidetes）中的Sphingobacteriia綱的細菌，說明相對微晶纖維素和羧甲基纖維素而言，其更容易降解D-水楊苷，產(chǎn)生β-葡糖苷酶。有研究表明，Sphingobacteriia綱中細菌可以降解BTEX（苯、乙苯、甲苯、二甲苯的統(tǒng)稱）［17］；擬桿菌門（Bacteroidetes）中 Flavobacteria綱的細菌可以產(chǎn)生視紫素［18］。

圖8 4℃下低溫降解復合系的濾紙酶活性

通過16S rDNA序列分析，分離到的低溫纖維素降解菌分屬15個屬。其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和黃桿菌屬（Flavobacterium）為主要菌屬。本文樣品采集地屬于溫帶較寒冷地區(qū)，與溫帶地區(qū)的菌種有一些類似，如Maki等［19］從加拿大（溫帶地區(qū)）造紙廠的污泥中篩選到的纖維素降解細菌主要以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，杜穎［20］從來自內(nèi)蒙古不同地區(qū)的樣品中篩選到的纖維素降解細菌也主要以假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為主。本文中分離得到的蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、Lelliottia、厄氏菌屬（Oerskovia）、劍 菌 屬（Ensifer）、 葉 桿 菌 屬（Phyllobacterium）、Ancylobacter、地桿菌屬（Pedobacter）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）等屬的細菌在降解纖維素方面報道較少。

圖9 4℃低溫降解復合系7天內(nèi)的濾紙降解率

圖10 4℃下低溫降解復合系7天內(nèi)的pH值變動

王玢等［21］在15℃下從黃海海底篩選到一株嗜冷纖維素降解細菌，其內(nèi)切葡聚糖酶酶活121.9 μg/mL、外切葡聚糖纖維二糖水解酶酶活102.2 μg/mL，李春艷等［22］在10℃下從生活垃圾土壤中篩選到一株低溫纖維素降解細菌FLX-1，內(nèi)切葡聚糖酶酶活為14.12 U/mL，Akila 等［23］在15℃下從牛糞沼氣池中篩選出一株嗜冷梭菌PXYL1，其內(nèi)切葡聚糖酶酶活為35.75 U/mg，β-葡萄糖苷酶活為0.89 U/mg，濾紙酶活為23.68 U/mg，崔秀秀等［14］對1株耐冷纖維素降解細菌HQ產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化后，內(nèi)切葡聚糖酶酶活達到32.5 U/mL；本文用于構(gòu)建低溫降解復合系組合中的菌株的外切葡聚糖纖維二糖水解酶酶活在13 U/mL-17 U/mL之間，內(nèi)切葡聚糖酶酶活在17 U/mL-33 U/mL之間，β-葡萄糖苷酶酶活在15 U/mL-18 U/mL之間，濾紙酶活在13 U/mL-33 U/mL之間。和以上幾種菌株的酶活性相比，本文在4℃下獲得的菌株的各類酶活并不太高，屬于中等水平，這可能與培養(yǎng)溫度有關(guān)，目前對于4℃低溫條件下獲得的產(chǎn)高纖維素酶活的菌株的研究報道較少。

自然環(huán)境中纖維素的降解多是由多種微生物協(xié)同完成的，微生物混合作用降解纖維素的效率及活性均比單獨菌株作用高。潘虎等［24］構(gòu)建了一個高效纖維素降解菌群SYF，培養(yǎng)10 d后，濾紙酶活性達126.3 U/mL，濾紙降解率為71.5%，酶活性低于本文的低溫降解復合系的最高濾紙酶活性，但其濾紙降解率很高；趙聽［25］構(gòu)建了小麥秸稈降解復合菌群FWD1，其濾紙酶活性為75.74 U/mL，其在7 d內(nèi)的濾紙降解率為10%，王巖［26］把5 株菌進行組合產(chǎn)生了13 個纖維素降解復合系，對其濾紙酶活力及其降解率進行了研究，其中組合F1F8F25的濾紙酶活性最高，為0.326 IU/g，其在8℃，48 h的濾紙降解率為28.08%，付秋玥［27］從農(nóng)村自然堆肥中篩出低溫纖維素降解菌組成的復合菌系X11F74濾紙酶活力可達 0.327 IU/g。本文低溫降解復合系組合中，D13'1''和D13'2''的濾紙酶活性最高，為158.02 U/mL，是單菌株酶活的5-10倍，在目前所報道的纖維素降解復合菌系中處于較高水平，4℃下的濾紙降解率分別為17.6%和18.8%，說明復合系中的不同菌株之間存在明顯的協(xié)同作用，具有較高的研究價值和應用價值，值得進一步的研究?；旌暇囵B(yǎng)體系中pH值的明顯變化會降低纖維素酶活性，導致復合菌群生長惡化，因此，在復合系的發(fā)酵中pH值的不穩(wěn)定是降低或抑制纖維素分解活性的主要原因之一［28］。通過監(jiān)測復合系D13'1''和D13'2''在降解濾紙過程中的酸堿度，復合系發(fā)酵液的pH值會穩(wěn)定在6.2-6.6范圍內(nèi)，說明復合系的纖維素降解穩(wěn)定性較好。由于低溫纖維素酶的最適作用溫度普遍較低，一般最適作用溫度為20-25℃［29］，本文是在50℃測定的纖維素酶活性，由于溫度較高會導致酶的活性受抑制［3］，還需進一步研究其最佳反應條件。

4 結(jié)論

在4℃下以微晶纖維素、CMC和D-水楊苷3種不同的底物從呼倫貝爾森林土壤中分離到172株低溫纖維素降解細菌，第一優(yōu)勢菌綱為γ-Proteobacteria，第二優(yōu)勢菌綱為α-Proteobacteria；第一優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas），第二優(yōu)勢菌屬為根瘤菌屬（Rhizobium）。將酶活性高的菌株分別混合構(gòu)建了27個低溫降解復合系，其中有9個復合系的濾紙酶活都在140 U/mL以上，D13'1''和D13'2''的酶活性最高，為158.02 U/mL，濾紙降解率分別為17.6%和18.8%，是低溫降解復合系最優(yōu)菌群組合。