黑曲霉在生物質(zhì)廢棄物資源化中的應(yīng)用

姚兵莉，張繼寧，藍娜娜，張建國

(1.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海201403)

生物質(zhì)是農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物、食品工業(yè)廢棄物和生活廢棄物中的主要成分，我國每年產(chǎn)出農(nóng)業(yè)廢棄物40多億t[1]，大約產(chǎn)生3 700萬m3的林業(yè)廢棄物[2]。食品工業(yè)中的肉類加工廠廢棄物每年產(chǎn)生約0.65億t，餅粕類0.25億t[3]。同時，每年產(chǎn)生的生活垃圾約為2.5億t。由于廢棄物數(shù)量大，如果廢棄物露天堆放不僅占用了大量的土地，而且會造成環(huán)境污染問題，更存在安全隱患。生物質(zhì)資源化是解決目前廢棄物污染、能源和環(huán)境問題的一種有前途的方法。生物質(zhì)既可以直接提供熱量，也可以制備液體燃料或者化學(xué)品，是一種可再生資源。由于人類對能源需求的日益增加和化石能源貯量的縮減，生物質(zhì)能源和生物基化學(xué)品的作用逐步凸顯，所以生物質(zhì)資源化非常有必要，也具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 生物質(zhì)的主要組分及其預(yù)處理方法

生物質(zhì)的主要組分為由葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵相互連接的纖維素；以木聚糖為主并包括木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯醛酸木聚糖、葡萄糖醛酸甘露聚糖組成的半纖維素；由酚類物質(zhì)(羥基或甲氧基取代的苯丙烷單體)聚合在一起的木質(zhì)素。

生物質(zhì)資源化利用效果一般不理想，主要原因為生物質(zhì)組分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解。例如，纖維素中葡萄糖環(huán)之間的夾角和側(cè)鏈與葡萄糖環(huán)之間的夾角變化較大，纖維素的聚合度低至幾百，高達上萬[4-5]；半纖維素中單糖和連接鍵類型也較多[6]；木質(zhì)素中不規(guī)則分布的甲氧基、酚羥基、羰基、丙烯醛基和松柏醇基使木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。不同種類生物質(zhì)中組分含量也有較大差別。這對生物質(zhì)的有效利用途徑造成一定困難。

圖1總結(jié)了常見的生物質(zhì)材料中主要組分的含量。纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約30%～50%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)約20%～30%，果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)約5%～30%，上述3類天然高分子聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在65%～90%波動。

圖1 幾種生物質(zhì)組成Fig.1 Components of several biomass

利用生物質(zhì)通常需要先預(yù)處理破壞其致密結(jié)構(gòu)，然后再利用酶法進行降解。預(yù)處理的過程可以打斷纖維素之間的鏈，去掉半纖維素的保護殘基，改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，達到打破生物質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)、增加生物質(zhì)組分與催化劑接觸面積的目的[7]。生物質(zhì)致密結(jié)構(gòu)的破壞程度取決于預(yù)處理方法和生物質(zhì)組分晶體結(jié)構(gòu)和聚合度[8]。預(yù)處理方法有稀酸處理、堿處理、蒸汽爆破處理、有機溶劑處理和氧化處理等[9]。

酸處理在120 ℃下采用20～40 g/L稀硫酸處理1.5 h，降解半纖維素和部分半纖維素。酸處理方法的優(yōu)點為簡單、易操作，不足之處在于去除木質(zhì)素效果不理想以及易產(chǎn)生抑制纖維素酶的糠醛、5-羥甲基糠醛等抑制劑[9]。

堿處理方法采用5～100 g/L NaOH、10～300 g/L CaCO3、50～300 g/L氨水、50～150 g/L CaO等溶液破壞木質(zhì)素。堿處理的優(yōu)點為過程簡便、成本低，減少抑制劑生成。但是堿處理的不足在于堿具有較強的腐蝕作用[10]。

蒸汽爆破方法為160～260 ℃條件下將飽和蒸汽滲入生物質(zhì)，然后突然釋放蒸汽壓力破壞生物質(zhì)致密結(jié)構(gòu)，加入少量硫酸、CO2、氨水與高壓蒸汽形成協(xié)同作用，提高破壞效果[11]。

有機溶劑處理為采用乙二醇、丙三醇、苯、二氧乙烷、和三氯化鐵或路易斯酸在160～200 ℃處理生物質(zhì)1～2 h，可以降解掉80%左右的木質(zhì)素和全部半纖維素[9]。

氧化處理利用O3、H2O2或O2在堿性條件下氧化分解纖維素和木質(zhì)素。氧化處理也產(chǎn)生較多糠醛和5-羥甲基糠醛等抑制劑[9]。

將預(yù)處理后的生物質(zhì)固體轉(zhuǎn)化為單糖或者化學(xué)品是進一步利用生物質(zhì)成分的重要途徑。由于生物質(zhì)組分和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，降解生物質(zhì)組分需要多種酶協(xié)同作用[12]。很多學(xué)者研究水解生物質(zhì)組分所需要的酶類。降解纖維素的酶有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。降解半纖維素的酶有內(nèi)切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、內(nèi)切-β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和p-香豆酯酶。降解木質(zhì)素的酶有木質(zhì)素過氧化酶、漆酶、錳過氧化酶、多樣性過氧化酶[13]等。絲狀真菌，尤其是黑曲霉，具有豐富的降解生物質(zhì)酶系，廣泛地被學(xué)者關(guān)注。而且，黑曲霉的遺傳操作較為成熟，是優(yōu)秀的細胞工廠，可以利用生物質(zhì)積累高附加值的物質(zhì)。為此，筆者總結(jié)黑曲霉在降解生物質(zhì)方面的優(yōu)勢，為黑曲霉在生物質(zhì)廢棄物資源化中的應(yīng)用提供參考。

2 黑曲霉具有豐富的降解生物質(zhì)酶系

絲狀真菌，例如黑曲霉、米曲霉、米根霉和里氏木霉[14]，是水解生物質(zhì)酶的重要來源。表1總結(jié)了4種絲狀真菌水解生物質(zhì)酶的研究水平。由于生物質(zhì)含有果膠[15]，所以表1也包含了水解果膠的酶。根據(jù)表1可以看出4種絲狀真菌所產(chǎn)生的酶類有所不同。在19種酶中，黑曲霉、米曲霉、米根霉和里氏木霉分別存在3、6、13、5種酶缺失。黑曲霉能產(chǎn)生的酶類最多，而且有11種來自黑曲霉的比酶活比來自里氏木霉的比酶活高。這說明黑曲霉更加適合作為產(chǎn)生水解生物質(zhì)酶的工業(yè)微生物。黑曲霉是一個表達工業(yè)用酶的模式微生物[16]，已經(jīng)有多種酶在黑曲霉中成功表達，例如木質(zhì)素過氧化酶[17]、阿魏酸酯酶[18]和錳過氧化酶[19]等。

表1 降解生物質(zhì)組分涉及的常見酶類

注：ND表示沒有具體活力數(shù)值；a表示此處酶活單位為U/mg;b表示此處酶活單位為U/mL。

預(yù)處理后得到的生物質(zhì)需要多種酶協(xié)同降解，但所需酶的組成也根據(jù)生物質(zhì)組分和預(yù)處理方法的不同而不同。例如，玉米芯經(jīng)過堿處理后需要50 U/g 葡聚糖的內(nèi)切纖維素酶、30 U/g 葡聚糖的外切纖維素酶和30 U/g 葡聚糖的β-葡萄糖苷酶進行水解[67]；大豆皮需要用50 U/g 纖維素的纖維素酶、15 U/g 纖維素的β-葡萄糖苷酶進行水解[68]。水解過程中外切纖維素酶應(yīng)該有足夠的活力以避免纖維二糖抑制內(nèi)切纖維素酶。利用生物質(zhì)培養(yǎng)微生物產(chǎn)酶，進而水解生物質(zhì)的效果比外加酶的效果好，這是由于省去了純化酶的步驟[7]。

近年來通過對多株黑曲霉基因組進行研究，結(jié)果也表明黑曲霉自身并不能產(chǎn)生水解生物質(zhì)組分需要的所有酶[69]。有學(xué)者利用多種微生物的協(xié)同作用來生產(chǎn)所需要的酶，從而達到單一微生物無法達到的作用，不僅提高了酶產(chǎn)量，也為微生物水解生物質(zhì)提供了思路[70]?；旌隙喾N微生物水解生物質(zhì)的不足在于控制多種酶的比例技術(shù)復(fù)雜，而且高菌體量降低了生物質(zhì)的利用率。黑曲霉被改造后可以高效表達多種外源酶[71]。利用黑曲霉同時表達多種酶水解生物質(zhì)是目前的熱門研究方向。為了避免一種微生物同時高效表達多種酶的困境，Brunecky等[72]開發(fā)出了一種具有多種纖維素酶活力的纖維素酶CelA。

3 黑曲霉作為優(yōu)秀的細胞工廠

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，圍繞黑曲霉的信息、研究技術(shù)和方法也較為完善。例如，已經(jīng)有多株代表性的黑曲霉菌株完成基因組測序[73]，進一步建立了蛋白質(zhì)分泌途徑，有利于黑曲霉表達外源基因[74]。通過優(yōu)化同源重組步驟中同源序列長度、載體構(gòu)型、打靶位點敲除了黑曲霉中的NHEJ(非同源結(jié)合)修復(fù)途徑的蛋白Ku70和蛋白Ku80，實現(xiàn)了可以定向同源重組的遺傳操作系統(tǒng)[75]。此外，通過強啟動子的開發(fā)、蛋白酶缺陷菌株的構(gòu)建、系統(tǒng)生物研究技術(shù)等方式將黑曲霉改造成優(yōu)秀的細胞工廠[71,76-77]。除了黑曲霉自身分泌很多種酶[78](表1)，黑曲霉作為細胞工廠已經(jīng)表達多種外源酶：木聚糖酶、葡萄糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、果膠甲酯酶、磷酸脂肪酶、植酸酶[79]、果膠酶、葡萄糖氧化酶[80]、木質(zhì)素過氧化酶、葡萄糖糖化酶和呋喃果糖苷酶[81]。黑曲霉表達真菌來源酶的表達量比其他來源的蛋白表達量高，這可能是由于真菌來源的蛋白在蛋白水解、糖基化等方面較為適合黑曲霉[82]。

目前，基于基因組數(shù)據(jù)也建立了黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控技術(shù)，有利于檸檬酸等代謝物的積累[83]。早在20世紀(jì)30～40年代黑曲霉就是生產(chǎn)檸檬酸的工業(yè)菌株。目前全世界99%的檸檬酸(150萬t/a)是由黑曲霉菌生產(chǎn)[71]。黑曲霉積累檸檬酸伴隨著多個酶的上調(diào)表達，其中13種酶對高產(chǎn)檸檬酸是必要的[84]。黑曲霉還可以生產(chǎn)葡萄糖酸(4.5 g/(L·h))[85]、半乳糖醛酸[86]和琥珀酸[87]。

黑曲霉還可以利用羥基化、氧化、還原、去甲基化、硫化、脫氯、開環(huán)和接合等反應(yīng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高附加值化合物[88]。例如，黑曲霉將丁酰乙酸乙酯還原為光學(xué)純度99%以上的3-(R)-羥基己酸乙酯[89]，轉(zhuǎn)化雜環(huán)化合物、環(huán)氧化合物和芳香族碳水化合物[88]、萜類化合物、類固醇和類黃酮等物質(zhì)成為藥物和化工中間體[90-91]。

隨著新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)/核酸酶)的出現(xiàn)，黑曲霉基因改造的效率得到快速的提高[92-93]。Sarkari等[94]報道瞬時表達Cas9可以100%整合基因的技術(shù)，還展示了基于CRISPR/Cas技術(shù)提高烏頭酸產(chǎn)量的效果。Zheng等[95]建立了基于CRISPR/Cas的黑曲霉U6啟動子表達系統(tǒng)。這些技術(shù)必將加速黑曲霉作為細胞工廠方面的應(yīng)用。

4 黑曲霉利用生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)高附加值產(chǎn)品

黑曲霉利用生物質(zhì)廢棄物可以產(chǎn)酶或者高附加值產(chǎn)品[96]。黑曲霉來源的酶制劑具有產(chǎn)量大、應(yīng)用范圍廣、安全性高的特點，已愈來愈受到人們的重視[71]。黑曲霉已成為工業(yè)應(yīng)用常見的菌種之一。已經(jīng)商品化的來自黑曲霉的酶有α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、糖化酶、過氧化氫酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、半纖維素酶、葡萄糖苷酶、橙皮苷酶、葡萄糖酶、單寧酶、柚苷酶、蛋白酶和果膠酶等。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)允許食品工業(yè)使用的酶以來自黑曲霉的酶數(shù)量最多。

4.1 纖維素酶

黑曲霉廣泛應(yīng)用于纖維素酶的生產(chǎn)[97]。黑曲霉的纖維素酶活力比來自里氏木霉的酶活高[98]。以生物質(zhì)為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶，既可以有效利用生物質(zhì)，又可以生產(chǎn)酶等高附加值產(chǎn)品。目前已有多種生物質(zhì)被用來培養(yǎng)黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶。例如，Chandra等[99]以落花生秸稈和麥麩為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力均顯著高于其他菌類的活力。黃凡等[100]以三七渣培養(yǎng)黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶的比酶活達73.23 U/g(以1 g濕三七基質(zhì)計)。Mandal等[101]以香蕉皮為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)生纖維素酶的羧甲基纖維素酶的比酶活(CMCase)和濾紙纖維素酶活力(FPase)分別達到111.05 U/g和9.45 U/g(以1 g干基質(zhì)計)。高大響等[102]以豆渣為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶的比酶活達475 U/g。喬君毅等[103]利用玉米秸稈培養(yǎng)黑曲霉3.314 8菌株，經(jīng)發(fā)酵后玉米秸稈的成分發(fā)生了變化：粗蛋白含量提高了1.2倍，粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了34%、19%、23%；黑曲霉產(chǎn)生的CMCase和FPase的比酶活別達29.94 U/g和13.56 U/g。Sharma等[104]利用豌豆莢廢料固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉HN-1得到濾紙纖維素酶(FB)的比酶活可達30 FPU/g。

還有很多學(xué)者嘗試從自然界分離高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株。Bansal等[105]從農(nóng)田土壤中分離的黑曲霉 NS-2以玉米芯、胡蘿卜皮、堆肥、雜草葉、橘子皮、菠蘿皮、番茄皮、稻殼、甘蔗渣、木屑、麩皮和麥秸稈培養(yǎng)都可以產(chǎn)生纖維素酶，其中，以小麥麩皮為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉NS-2產(chǎn)生的纖維素酶活力最高(CMCase 310 U/g、FPase 17 U/g)。Cunba等[106]從黑胡椒中分離出黑曲霉菌株A12，分別用甘蔗渣和甘蔗渣水解液培養(yǎng)后纖維素酶的生產(chǎn)強度達57 U/(L·h)。李蘭曉等[107]利用啤酒糟培養(yǎng)1株黑曲霉后產(chǎn)生的纖維素酶CMCase和FPase的比酶活分別達到14 187.8 U/g和759.9 U/g(以1 g干基質(zhì)計)。因此，篩選高產(chǎn)纖維素的黑曲霉菌株是非常重要的方向，也具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.2 半纖維素酶

木聚糖酶是半纖維素酶類的重要組成部分，可以分解飼料原料細胞壁中半纖維素的木聚糖，降低物料的黏度，促進有效物質(zhì)的釋放，以利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時木聚糖水解得到的低聚木糖作為功能性低聚糖，可促進機體對酸性飲料和發(fā)酵食品中鈣的吸收[108]。所以木聚糖酶不僅在生物質(zhì)利用中有重要作用。魏桃英等[109]優(yōu)化了含玉米芯和豆餅粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉后產(chǎn)生26 371 U/g的木聚糖酶。王維超等[110]采用蘋果渣為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)生木聚糖酶的酶活達到5 736 U/g、β-甘露聚糖酶的酶活達到896.24 U/g(以1 g干基質(zhì)計)。Desai等[111]在16株黑曲霉菌株中篩選到的黑曲霉DX-23可產(chǎn)48.9 U/mL木聚糖酶，該木聚糖酶可以有效脫除舊報紙漿的油墨，使舊報紙漿的亮度提高78.8%，對這株黑曲霉繼續(xù)紫外誘變后木聚糖酶的酶活可提高到 150.9 U/mL[112]。

高木糖含量的玉米棒和麥麩等廢棄物是誘導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)生木聚糖酶的良好物質(zhì)。Dobrev等[113]以玉米芯為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉B03，使其木聚糖酶活力提高了33%。Ottenheim等[114]以棕櫚果殼為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉DSM 26641產(chǎn)生24.5 mU/mL木聚糖酶，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示這株菌產(chǎn)生3種木聚糖內(nèi)切酶、2種β-木糖苷酶、4種阿拉伯呋喃糖酶、1 種乙酰木聚糖酯酶、2 種阿魏酸酯酶。黑曲霉SCTCC 400264產(chǎn)生耐熱的木聚糖酶的比酶活可達2 547.7 U/mg，該木聚糖酶在80 ℃條件下保持30 min仍有74%活力[115]。從印度Baramura森林中分離得到的黑曲霉KP874102.1產(chǎn)生的木聚糖酶的比酶活達到426 178 U/mg[116]。

4.3 木質(zhì)素降解酶

黑曲霉ATCC 1015基因組中有多個可能的漆酶序列，McoB基因已經(jīng)被證實可以表達較高量的漆酶[117]。Ishfaq等[55]利用RAPD技術(shù)分析了10株黑曲霉，鑒定出1株高產(chǎn)漆酶的黑曲霉菌株。利用玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉CGMCC 5992，產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化酶的酶活達到652.34 U/L[53]。雖然黑曲霉本身不產(chǎn)生錳過氧化酶和多樣性過氧化酶，但是Cortes-Espinosa等[19]利用黑曲霉作為宿主高效表達了黃孢原毛平革菌的錳過氧化酶，并且成功用于降解土壤中的菲。雖然還沒有在黑曲霉中表達多樣性過氧化酶的研究，但是已經(jīng)實現(xiàn)了黃曲霉表達杏鮑菇多樣性過氧化酶的研究[118]，所以利用黑曲霉表達多樣性過氧化酶也很有希望。

4.4 果膠酶

果膠酶已經(jīng)用于果汁澄清、果蔬汁提取、果實脫皮、木材防腐、麻類脫膠和棉織物精煉加工等行業(yè)[119]。黑曲霉可以產(chǎn)生3種果膠酶：果膠裂合酶[58]、聚半乳糖醛酸酶[62]和轉(zhuǎn)化酶[65]。黑曲霉利用生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)生果膠酶的研究有很多。例如，曹珂珂等[120]以葡萄渣為基質(zhì)利用黑曲霉BB-6產(chǎn)生12.23 U/g干基質(zhì)的果膠酶。近年來研究人員通過原生質(zhì)體突變[121]、紫外線誘變[122]以及紫外與LiCl復(fù)合誘變[123]等方式提高黑曲霉產(chǎn)生的果膠酶產(chǎn)量。

4.5 高附加值產(chǎn)品

黑曲霉可以提升食品廢棄物的品質(zhì)，提高其附加值。例如，利用黑曲霉在豆渣上生長提高其可溶性膳食纖維的品質(zhì)[124]，改善豆渣的口感[125]，改善米糠粕可溶性纖維的品質(zhì)[126]。黑曲霉還可以利用香蕉皮制備可溶性膳食纖維[127]，從韭籽粕、豆粕和核桃粕中提取多肽[128]，從豆粕中制備大豆異黃酮[129]。黑曲霉還用于從玉米廢棄物制備蛋白質(zhì)[130]，和酵母一起轉(zhuǎn)化秸稈為生物乙醇[131]。

5 展望

隨著可持續(xù)發(fā)展的概念深入人心，生物質(zhì)廢棄物資源化利用是可持續(xù)發(fā)展的必要組成部分。黑曲霉在生物質(zhì)資源化利用中的主要優(yōu)勢為黑曲霉作為食品安全級的微生物已經(jīng)應(yīng)用于很多方面。黑曲霉具有較豐富的自身水解酶系，黑曲霉的遺傳操作技術(shù)較成熟，為黑曲霉同時產(chǎn)生水解生物質(zhì)組分的全酶系提供技術(shù)支撐，黑曲霉可以積累多種高附加值物質(zhì)，這些優(yōu)勢有助于黑曲霉在生物質(zhì)資源化過程中發(fā)揮作用。

但是，黑曲霉在生物質(zhì)資源化利用過程中仍有大量的工作需要開展。首先，解析黑曲霉調(diào)控表達水解酶的機制。黑曲霉利用不同生物質(zhì)組分時表達不同水解酶。這說明黑曲霉可以感應(yīng)底物組分，并進行相應(yīng)的反饋。探究黑曲霉控制水解酶表達的轉(zhuǎn)錄機制，解析表達機制有利于調(diào)控黑曲霉表達水解酶系。其次，構(gòu)建高效表達全酶系的工業(yè)菌株。近年來基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為黑曲霉表達多種外源酶提供了技術(shù)支撐，但是目前還沒有關(guān)于表達水解生物質(zhì)全酶系的黑曲霉菌株的報道。最后，優(yōu)化生物過程高效利用生物質(zhì)。黑曲霉利用水解酶將生物質(zhì)資源化的過程受到生物過程中多個條件的影響，例如傳質(zhì)、傳熱等，所以生物過程的控制也是重要研究內(nèi)容。隨著研究的深入，黑曲霉將在生物質(zhì)資源化方面發(fā)揮更大的作用，不僅推進生物質(zhì)資源化利用的進程，還為黑曲霉的應(yīng)用提供了舞臺。