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    沙門氏菌CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶基因分型及變異研究

    2019-08-08 00:45:08
    中國人獸共患病學報 2019年7期
    關鍵詞:沙門氏菌分型基因型

    從20世紀80年代以來,在廣譜頭孢菌素等β-內酰胺類抗生素(尤其是廣譜頭孢菌素)的選擇壓力下,催生了新型β-內酰胺酶包括CTX-M、TEM、SHV、PER、VEB、BES、GES、TLA、SFO和OXA等,這類酶能夠降解并賦予對這些抗生素的耐藥性[1]。CTX-M以高度水解頭孢噻肟、輕度水解頭孢他啶為特征,水解活性可被β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等抑制[2];迄今為止,已發(fā)現至少109種CTX-M型及相關變體[3]。前期的研究中,我們分析了S.enteritidis(ST11克隆)、S.indiana(ST17克隆)、S.thompson(ST319)等常見沙門氏菌,發(fā)現這類菌的耐藥與CTX-M有相關性;同時發(fā)現了起源于禽的ST17超級耐藥克隆(ST17-XDR clone),并預測ST319有可能是下一個超級耐藥克隆,CTX-M是這類超級耐藥克隆出現的主要原因[4-5]。研究發(fā)現質粒在CTX-M耐藥基因傳遞過程中有著重要作用[6]。通過對常見血清型腸炎沙門氏菌 (S.enteritidis)、印第安納沙門氏菌(S.indiana)、湯卜遜沙門氏菌(S.thompson) 等CTX-M分子基因型別、脈沖場凝膠電泳(PFGE)溯源分析及CTX-M氨基酸位點變異情況,研究CTX-M各型別流行特征及在超級耐藥克隆中的作用,為沙門氏菌耐藥及感染控制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1菌株來源 研究采用江蘇及周圍地區(qū)2013-2016年間豬、雞基線調查、農貿市場食品及食品從業(yè)人員、哨點監(jiān)測腹瀉病人及食物中毒病人收集S.enteritidis、S.indiana、S.thompson等主要血清型菌株共197株,在前期的研究中,完成CTX耐藥表型及相應CTX耐藥基因的檢測,對頭孢噻肟耐藥且攜帶CTX-M基因共有61株[4-5],包括S.indiana45株,S.enteritidis7株,S.thompson7株,鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)2株(表1)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1CTX基因的分群試驗 參照已發(fā)表方法設計引物對CTX-M陽性株通過PCR試驗進行分群試驗[7]。PCR產物通過商業(yè)測序公司進行測序,序列通過與Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) (https://card.mcmaster.ca/analyze) 數據庫BLAST 注釋其CTX-M基因型。

    1.2.2脈沖場凝膠電泳 參照中國細菌性傳染病分子分型實驗室監(jiān)測網絡 Pulse Net China 的沙門氏菌 PFGE 分子分型方法,用 SeaKem glod agarose 將沙門氏菌包埋,用XbaI進行酶切,把所得到的 DNA 片段用 Chefmapper 進行脈沖場凝膠電泳分型,最后將成像結果用Bionu-merics7.6軟件聚類分析。

    1.2.3基因測序 根據CTX-M分型及前期耐藥克隆研究結果[4-5],選取9株S.indiana,2株S.thompson及1株S.enteritidis共12株進行全基因測序分析。菌株利用TAKARA DNA提取試劑盒提取DNA,由商業(yè)測序公司使用PacBio○RRS II System進行全基因組測序。序列拼接使用SPAdes-3.5.0軟件對預處理后的Illumina 數據和PacBio數據進行拼接組裝。所得基因序列用相應的數據庫注釋其結果。

    2 結 果

    2.1CTX基因分型 61株CTX陽性的菌株分為3個亞群6個型。主要為CTX-M-9亞群(33株),其次為CTX-M-1亞群(27株)。主要型別為CTX-M-65(29株)和CTX-M-55 (24株)。S.indiana攜帶這6種CTX-M基因型,主要為CTX-M-65及CTX-M-55基因型;S.thompson主要為CTX-M-65基因型;S.enteritidis主要為CTX-M-55基因型。 禽源分離株中檢測到5種CTX-M基因型,主要為為CTX-M-65及CTX-M-55基因型(表1)。

    2.2PFGE分型結果 根據PFGE分子圖譜總體上分為4個基因簇 (cluster),對應相應血清型。按照聚類分析70%相似度分類,可以將CTX-M陽性菌株分為19個型。A2,B4,B8,B9,D2等為主要型。A2主要是S.enteritidis攜帶CTX-M-55型; B4,B8,B9主要是S.indiana,主要攜帶CTX-M-55型和CTX-M-65型;D2為S.thompson,攜帶CTX-M-65型(圖1)。

    表1 沙門氏菌不同血清型攜帶CTX-M分型結果

    Tab.1 CTX-M genotypes in differentSalemonellaserotypes

    血清型(No.)CTX-M群CTX-M型來源(No.)S.indiana(45)CTX-M-1群CTX-M-55禽源(14),人源(1),食源(1),豬源(2)CTX-M-79禽源(2),人源(1)CTX-M-9群CTX-M-14禽源(1),環(huán)境(1)CTX-M-27禽源(1)CTX-M-65禽源(20)CTX-M-64群CTX-M-123食源(1)S.enteritidis(7)CTX-M-1群CTX-M-55禽源(5),人源(1)CTX-M-9群CTX-M-65禽源(1)S.thompson(7)CTX-M-9群CTX-M-14食源(1)CTX-M-65禽源(6)S.typhimurium(2)CTX-M-9群CTX-M-65禽源(2)

    圖1 61株CTX-M菌株PFGE聚類圖及CTX-M基因型別與血清型、來源間關系Fig.1 Dendrogram displaying PFGE genotypes with CTX-M genotypes, serotypes and the sources of 61 isolates

    2.3CTX-M基因型的氨基酸突變位點 12株全基因測序中,包括本研究中全部6種CTX-M型,CTX-M-55,CTX-M-79, CTX-M-14,CTX-M-27,CTX-M-65, CTX-M-123;其中9株S.indiana中含全部6種CTX-M型;2株S.thompson及1株S.enteritidis均為CTX-M-55型。與已發(fā)表的CTX-M-1型(GenBank: AMM70777.1)、CTX-M-9型 (NCBI Reference Sequence: WP_032489926.1)和CTX-M-64型(NCBI Reference Sequence: WP_032492042.1)分別屬于CTX-M-1群、CTX-M-9群和CTX-M-64群的序列作為參照進行比較。

    經比對發(fā)現CTX-M-1、CTX-M-55和CTX-M-79,CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-27和CTX-M-65,CTX-M-64和CTX-M-123均含有291個氨基酸。在CTX-M-1群中,易變化的主要是4個氨基酸位點:1,117,143,298。在CTX-M-9群中,易變化的主要是3個氨基酸位點:80,234,242。在CTX-M-64群中,易變化的主要是12個氨基酸位點:70, 86, 89, 90,91,92,97, 102, 103, 121, 230, 233。同一CTX-M基因群中,基因發(fā)生突變的氨基酸位點是固定的(表2)。

    3 討 論

    本研究中的CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶主要禽源出現,但在豬源、人源、食源以及環(huán)境均有涉及;出現了6個CTX-M基因型,主要為CTX-M-65和CTX-M-55。由于地域差異,不同地區(qū)出現的CTX-M的型別有所不同。國際上,澳洲、美國以CTX-M-15最為常見、拉丁美洲以CTX-M-2常見、歐洲西班牙以CTX-M-9和CTX-M-14常見[3,8-10]。 本文結果表明江蘇及周圍地區(qū)主要為CTX-M-65和CTX-M-55,與國內動物分離株的研究報道的結果類似[11-13]。禽源ST17克隆中攜帶多種CTX-M基因,以CTX-M-55和CTX-M-65為主,且S.thompson則也攜帶CTX-M-14和CTX-M-65; CTX基因型復雜且多變可能是超級耐藥克隆形成并廣泛流行的原因之一。

    表2 CTX-M群的CTX-M基因型氨基酸突變

    Tab.2 CTX-M amino acid serial variation in different CTX-M groups

    CTX-M群CTX-M分型氨基酸位點17080868990919297102103117121143230233234242275289CTX-M-1群CTX-M-1H——————————D—S—————NCTX-M-55M——————————N—A—————DCTX-M-79M——————————N—A—————NCTX-M-9群CTX-M-9——A—————————————AD—SCTX-M-14——A—————————————VD—SCTX-M-27——A—————————————VG—SCTX-M-65——V—————————————VD—RCTX-M-64群CTX-M-64—P—QTQKQPPA—T—AV————CTX-M-123—A—KSEPNRKS—S—TT————

    注:H:組氨酸、D:天冬氨酸、S:絲氨酸、N:天冬酰胺、M:蛋氨酸、A:丙氨酸、V:纈氨酸、G:甘氨酸、R:精氨酸、P:脯氨酸、Q:谷氨酰胺、T:蘇氨酸、K:賴氨酸、E:谷氨酸;-:該位置的氨基酸相同

    PFGE分子分型結果表明,CTX-M型別與血清型、地區(qū)來源及分子型密切相關。PFGE A2亞型中,是來自不同地區(qū)的S.enteritidis多數為CTX-M-55型;B4亞型中都是來源于同一地區(qū)ST17且都為CTX-M-55;最大的亞型B8中是來源于不同地區(qū)的ST17,CTX-M-65與CTX-M-55各半。D2亞型中都是來源于同一地區(qū)的ST319克隆的CTX-M-65。主要相同的分子型別中多數菌株為禽源,少數為人源,進一步佐證動物源性耐藥基因是人源耐藥基因的主要來源[4-5]。PFGE分子分型表明,血清型、地區(qū)和來源是影響CTX-M基因型多樣性的重要因素。

    根據全基因測序氨基酸比較結果顯示,CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶氨基酸位點易突變,且同群的變易氨基酸的位點是相同的,但群之間易變異氨基酸位點是不同的;CTX-M氨基酸位點多變且同群CTX-M基因型即使1位氨基酸位點突變就導致基因型別發(fā)生改變[2-3]。研究表明,CTX-M同群的菌株對β-內酰胺類抗生素耐藥狀況基本相同,而不同群間的菌株對β-內酰胺類抗生素耐藥差異較大[14-15],氨基酸突變導致CTX-M基因型及對β-內酰胺類抗生素抗藥性的變化。

    CTX-M基因大部分位于質粒上,不但可以進行水平傳播還可以進行垂直傳播[3,11]。位于質粒上的CTX-M基因遺傳穩(wěn)定性差,上游具有固定插入序列ISEcp1,下游插入序列較多,常見的為IS903、IS26等,使得CTX-M基因可在沙門氏菌與腸桿菌科之間以及沙門氏菌與其它種屬細菌之間進行快速的傳播,這是其水平傳播的關鍵因素[12-13]。國內Wang W等及Wang J等分別報道了S.indianaST17克隆菌株C629及D90分別含有一個及多個攜帶有耐藥基因的質粒。 其中pD90-1 (GenBank accession:CP022451) 攜帶CTX-M-65基因[16-17]。 本研究1株攜帶有CTX-M-27基因的典型ST17克隆菌株全基因測序(GenBank accession: CP031189,CP031190, CP031191)結果表明,該基因位于一小質粒上(GenBank accession: CP031191),其前后分子組成為: ISEcp1-blaCTX-M-27-IS903。以上結果表明,耐藥質粒是超級耐藥克隆產生的主要原因。

    利益沖突:無

    引用本文格式:余菊,徐紅紅,申永秀,等.沙門氏菌CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶基因分型及變異研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(7):594-598. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.080

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