2A肽介導(dǎo)的割手密ScNAC1、ScDREB融合基因表達(dá)載體構(gòu)建

徐 榮，吳清蓮，孟 玉，陳疏影,2，王先宏,2，何麗蓮，李富生*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所，云南 昆明 650201)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中國(guó)最主要的糖料作物之一，也是最具潛力的生物質(zhì)能源作物之一[1]，富含鐵、鈣、磷及各種氨基酸，具有廣闊的產(chǎn)品開發(fā)空間和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。近年來(lái)，全球干旱化嚴(yán)重尤其云南蔗區(qū)常年干燥缺水，亟待選育出高糖、高產(chǎn)且抗旱的甘蔗品種以抵御極端氣候[2]。但是，常規(guī)育種很難在短期內(nèi)選育出滿足生產(chǎn)需要的甘蔗新品種，將外源基因?qū)胱魑锲贩N進(jìn)行定向育種，可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得高產(chǎn)、高抗的作物品種，轉(zhuǎn)基因育種已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的、傳統(tǒng)雜交育種方式的有效補(bǔ)充手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物的一些代謝途徑或數(shù)量性狀的遺傳修飾是由多基因控制的，單個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化已經(jīng)不足以滿足植物改良的需要，多基因轉(zhuǎn)化研究應(yīng)運(yùn)而生，并迅速發(fā)展[3]。目前，多基因轉(zhuǎn)化主要有雜交法、再轉(zhuǎn)化法、共轉(zhuǎn)化法、基因連接法及多順?lè)醋愚D(zhuǎn)基因等。其中，由2A肽段介導(dǎo)的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)基因的多基因載體構(gòu)建策略受到廣泛關(guān)注，在這一策略中多個(gè)基因共用一個(gè)啟動(dòng)子和終止子表達(dá)，具有載體較小、高效表達(dá)、定點(diǎn)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的多基因表達(dá)策略[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以前期在割手密中克隆到的具有抗旱功能ScNAC1和ScDREB為目的基因，以對(duì)單子葉植物高效、專一的Ubiquitin為啟動(dòng)子，以適于單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pCAMBIA1300-nu為基礎(chǔ)載體，通過(guò)改造后的FMDV2A多肽連接，采用重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱SOE PCR)將ScNAC1和ScDREB基因相融合，獲得融合基因表達(dá)載體?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在探索甘蔗實(shí)現(xiàn)一次多基因遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，并探討多基因整合的相互作用問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

含有玉米Ubi啟動(dòng)子的pCAMBIA1300-nu植物表達(dá)載體、含有割手密ScNAC1的pFGC941-ScNAC1-GFP表達(dá)載體、含有ScDREB的pFGC941-ScDREB-GFP表達(dá)載體、大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，均由本課題組保存。

KOD DNA聚合酶購(gòu)自Toyobo公司，限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取與純化試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；重組試劑盒購(gòu)自Vazyme公司；Ladder DNA marker購(gòu)自Tiangen公司；卡那霉素(Km)、利福平(Rif)購(gòu)自Solarbio公司；瓊脂糖購(gòu)自GENE公司；PCR引物合成及基因測(cè)序均由上海生工完成。

1.2 引物設(shè)計(jì)

1.2.1 線性化載體上下游引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已知的ScNAC1和ScDREB基因序列，參照ClonExpress?II(諾唯贊，C112)說(shuō)明書，在插入片段正反向擴(kuò)增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，即5’-上游載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn) + 基因特異性正向擴(kuò)增引物序列-3’、5’-下游載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn) + 基因特異性反向擴(kuò)增引物序列-3’，這樣可以使擴(kuò)增后的插入片段5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)一致的同源序列。依據(jù)以上原理，分別設(shè)計(jì)ScNAC1-2A-ScDREB融合片段PCR擴(kuò)增的引物為表1中的1NF、1DR；ScDREB-2A-ScNAC1融合片段PCR擴(kuò)增的引物見(jiàn)表1中的2DF、2FR，以便與線性化載體上/下游末端進(jìn)行同源重組。

1.2.2 融合基因片段間引物設(shè)計(jì) 首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載到來(lái)自口蹄疫病毒FMDV 2A的核苷酸序列，并根據(jù)參考文獻(xiàn)在上游蛋白與2A間加入甘氨酸-色氨酸-甘氨酸(GSG)等構(gòu)象靈活氨基酸序列，以提高2A肽段的剪切效率，促進(jìn)基因表達(dá)[5-7]。利用這段改造過(guò)的2A多肽將ScNAC1和ScDREB基因按照不同前后順序串聯(lián)在一起。改造過(guò)的2A多肽有69個(gè)核苷酸：ggatccggcCAATTGCTTAACTTCGACTTATTGAAGCTTGCTGGTGACGTTGA

GTCTAACCCAGGTCCA，編碼23個(gè)氨基酸：GSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGP。表1中的1NR、1DF、2DR、2NF分別為2個(gè)載體的融合部分引物，其中黑色序列無(wú)下劃線序列分別為ScNAC1基因的3’、5’端互補(bǔ)序列和ScDREB基因的3’、5’端互補(bǔ)序列，黑色單下劃線序列為改造后的2A序列，黑色雙下劃線為融合基因反向互補(bǔ)序列，該互補(bǔ)序列可以滿足SOE PCR擴(kuò)增是將ScNAC1和ScDREB基因連接在一起的需要(圖2)。引物交由上海生工合成。

1.3 融合片段的獲得

1.3.1ScNAC1和ScDREB基因的獨(dú)立擴(kuò)增 按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行ScNAC1和ScDREB基因的獨(dú)立擴(kuò)增，擴(kuò)增使用KOD DNA聚合酶、以pFGC941-ScNAC1-GFP質(zhì)粒為模板，利用引物1NF與1NR擴(kuò)增ScNAC1-2A片段(PCR產(chǎn)物1)；以pFGC941-ScDREB-GFP質(zhì)粒為模板，利用引物1DF與1DR擴(kuò)增2A-ScDREB片段(PCR產(chǎn)物2)；以pFGC941-ScNAC1-GFP質(zhì)粒為模板，利用引物2DF與2DR擴(kuò)增ScDREB-2A片段(PCR產(chǎn)物3)；以pFGC941-ScDREB-GFP質(zhì)粒為模板，利用引物2NF與2NR擴(kuò)增2A-ScNAC1片段(PCR產(chǎn)物4)；PCR擴(kuò)增體系：1 μl模板DNA、2 μl 10×Buffer、2 μl dNTP Mixture (10 mM)、2 μl MgSO4(25mM)、0.6 μl Primer F (10 μM)(1NF/1DF/2DF/2NF)、0.6 μl Primer R (10 μM)(1NR/1DR/2DR/2NR)、0.5 μl KOD (1 U/μl)、ddH2O補(bǔ)齊20 μl體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min、32 個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸5 min，25 ℃保溫，4 ℃保存。將獲得擴(kuò)增產(chǎn)物分別用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，確定目的條帶后，切膠回收。

1.3.2 PCR擴(kuò)增融合基因 分別測(cè)定各回收產(chǎn)物中目的片段的濃度，并稀釋成同一濃度，取0.6 μl產(chǎn)物P1、0.4 μl產(chǎn)物P2預(yù)混后作為模板，采用引物1NF、1DR擴(kuò)增融合基因ScNAC1-2A-ScDREB；取0.4 μl產(chǎn)物P3、0.6 μl產(chǎn)物P4預(yù)混后作為模板，采用引物1NF、1DR擴(kuò)增融合基因ScDREB-2A-ScNAC1；采用重疊延伸技術(shù)SOE PCR一步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如表2，擴(kuò)增程序同單基因擴(kuò)增。

表1 擴(kuò)增引物

注：灰色序列為pCAM1300nu載體同源序列，黑色序列為目的基因部分序列，單下劃線序列為2A部分序列，雙下劃線為融合基因反向互補(bǔ)序列，斜體序列為酶切位點(diǎn)。

Note: The gray sequence is the homologous sequence of pCAM1300nu vector; The black sequence is the partial sequence of the target gene; The single underlined sequence is the partial sequence of 2A; The double underlined sequence is the reverse complementary sequence of fusion gene; The italic sequence is the restriction site.

1.4 融合基因片段與p1300nu同源重組及轉(zhuǎn)化

先用BamH I與SacI將pCAM1300-nu質(zhì)粒線性化雙酶切并回收，使用電泳比較條帶亮度的方法對(duì)載體和插入的融合基因片段進(jìn)行定量，參照諾唯贊C112-ClonExpress-II One Step Cloning Kit說(shuō)明書，按照載體與插入片段摩爾比為1∶2的分別取線性化載體(100 ng/μl)2 μl、融合基因片段(20 ng/μl)4 μl；5×CE II Buffer 4 μl；Exnase II 2 μl；加ddH2O 8 μl至20 μl的重組反應(yīng)體系，配制時(shí)在冰上操作。使用移液槍輕輕洗打混勻(不能震蕩混勻)，并短暫離心，在PCR儀上37 ℃反應(yīng)30 min后，降至4 ℃或立即置于冰上，-20 ℃冰箱可存放7 d備用。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 大腸桿菌，在Kan抗性的LB平板上進(jìn)行篩選，PCR及酶切驗(yàn)證后選擇陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

表2 融合基因擴(kuò)增PCR體系

2 結(jié)果與分析

2.1 待融合片段的獲得

以pFGC941-ScNAC1-GFP質(zhì)粒為模板，采用1NF和1NR引物擴(kuò)增得到的片段P1(ScNAC1-2A)，長(zhǎng)度為1259 bp，包含去掉終止密碼子的ScNAC1和2A序列5’端的50 bp；采用引物2NF和2NR擴(kuò)增得到片段P4(2A-ScNAC1)，其中長(zhǎng)度為1251 bp，包含2A序列3’端的39 bp和ScNAC1；凝膠電泳分析結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1200 bp，符合預(yù)期，而且條帶清晰、沒(méi)有雜帶、特異性強(qiáng)(圖1 a,b)。采用引物1DF和1DR擴(kuò)增得到片段P2(2A-ScDREB)，長(zhǎng)度為915 bp，包含2A序列3’端的39 bp和ScDREB，采用2DF和2DR引物擴(kuò)增得到的片段P3(ScNAC1-2A)，長(zhǎng)度為923 bp，包含去掉終止密碼子的ScDREB和2A序列5’端的50 bp；凝膠電泳分析結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1200 bp，符合預(yù)期，而且條帶清晰、沒(méi)有雜帶、特異性強(qiáng)(圖1 c,d)。

a：片段P1 (ScNAC1-2A)；b：片段P2(2A-ScNAC1)；c：片段P3(2A-ScDREB)；d：片段P4(ScDREB-2A)a: Fragment P1 (ScNAC1-2A); b: Fragment P2 (2A-ScNAC1); c: Fragment P3 (2A-ScDREB); d: Fragment P4 (ScDREB-2A)圖1 待融合片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products to be fused

2.2 融合基因的獲得

上述擴(kuò)增得到的 P1和P2片段按比例混勻后，以此為模板，采用1NF和1DR引物擴(kuò)增，得到融合基因ScNAC1-2A-ScDREB，長(zhǎng)度為2154 bp；將P3和P4片段按比例混勻后，以此為模板，采用2DF和2FR引物擴(kuò)增，得到融合基因ScDREB-2A-ScNAC1，同樣長(zhǎng)度也為2154 bp，凝膠成像結(jié)果表明，以上兩段融合基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均約為2200 bp，符合預(yù)期，而且條帶清晰、沒(méi)有雜帶、特異性較強(qiáng)(圖2)。圖3為SOE PCR 重組融合基因ScNAC1-2A-ScDREB的策略示意圖。

2.3 融合基因表達(dá)載體的獲得

將被BamH I與SacI線性化雙酶切的p1300nu質(zhì)粒與上述步驟獲得的融合基因ScNAC1-2A-ScDREB、ScDREB-2A-ScNAC1分別進(jìn)行同源重組，獲得的重組產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖4)，都切出了載體的大條帶和連接片段的小條帶，證明連接成功。于是，分別將重組產(chǎn)物命名為p1300:ScNAC1:2A:ScDREB、p1300:ScDREB:2A:ScNAC1。圖5為載體構(gòu)建示意圖。

a：融合片段ScNAC1-2A-ScDREB；b：融合片段ScDREB-2A-ScNAC1a: Fusion fragment ScNAC1-2A-ScDREB; b: Fusion fragment ScDREB-2A-ScNAC1圖2 融合基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of fusion genes

圖3 SOE PCR 重組融合基因 ScNAC1-2A-ScDREB的策略Fig.3 Construction of ScNAC1-2A-ScDREB by splicing by overlap extension(SOE)

a：質(zhì)粒 p1300:ScNAC1:2A:ScDREB；b：質(zhì)粒p1300:ScDREB:2A:ScNAC1。a: Plasmid p1300: ScNAC1:2A:ScDREB; b: Plasmid p1300: ScDREB:2A:ScNAC1.圖4 重組產(chǎn)物的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion analysis of recombinant products

圖5 融合基因表達(dá)載體構(gòu)建Fig.5 Construction of fusion genes expression vector

2.4 融合基因測(cè)序

酶切驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重DH5α大腸桿菌，選擇陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了擴(kuò)增產(chǎn)物額正確性，融合基因ScNAC1-2A-ScDREB、ScDREB-2A-ScNAC1在擴(kuò)增過(guò)程中皆無(wú)突變發(fā)生。

3 討 論

現(xiàn)有的多基因表達(dá)載體構(gòu)建策略最主要的不足之處在于載體容納能力有限，同一載體上的多基因表達(dá)不均衡，其蛋白活性及表達(dá)效率不及單基因表達(dá)載體[8]。自剪切2A 肽的融合基因策略不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，利用引物互補(bǔ)方法可簡(jiǎn)單迅速的將2個(gè)甚至2個(gè)以上DNA片段連在一起，規(guī)避了多基因表達(dá)時(shí)蛋白活性不高或下游基因表達(dá)量低等缺點(diǎn)[9]。Yeo等[10]利用2A 肽連接海藻糖-6-磷酸合成酶1 與海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)其具有刺激馬鈴薯合成海藻糖而增強(qiáng)其抗旱能力。Ralley等[11]將從海洋細(xì)菌中獲取的胡蘿卜素4,4'-氧合酶和3,3'-羥化酶基因，通過(guò)2A 肽進(jìn)行連接，遺傳轉(zhuǎn)化到不能合成酮類胡蘿卜素的高等植物(如西紅柿和煙草等)中，賦予了西紅柿和煙草生產(chǎn)蝦青素以及斑蝥素的能力。本研究運(yùn)用2A 肽將具有抗旱功能的ScNAC1和ScDREB基因連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)2個(gè)基因的共表達(dá)。為避免上游蛋白信號(hào)肽影響 2A 肽的剪切效率，導(dǎo)致下游蛋白出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[12]，可在2A 肽的上游添加一段氨基酸殘基，如 GSG 或 SGSG，以增加2A 肽的剪切效率，促進(jìn)下游蛋白正確定位，同時(shí)也可改變 2A肽上下游基因的順序[13]?；诖?，在上游基因與2A序列之間添加了一段氨基酸殘基 Gly-Ser-Gly，并分別設(shè)置了ScNAC1-2A-ScDREB和ScDREB-2A-ScNAC1兩種組合，以探討不同位置組合基因表達(dá)的差異，探索2個(gè)基因的位置效應(yīng)。

重疊PCR(gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱SOE PCR)技術(shù)包括一步法和二步法[8]，具有不需要酶切位點(diǎn)，不需要在基因序列中引入的堿基序列的優(yōu)點(diǎn)。張麗麗等[14]以多毛番茄抗冷轉(zhuǎn)錄因子LhCBF1基因、EGFP基因及RD29A啟動(dòng)子進(jìn)行SOE PCR，二步法步驟相對(duì)繁瑣，但在第一步時(shí)，融合基因模板得到大量擴(kuò)增可得到更高濃度的產(chǎn)物，但也存在非特異性擴(kuò)增；而一步法，由于模板延伸和基因擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，產(chǎn)物濃度相對(duì)較低，但具有較高特異性。本研究采用一步法，獲得具有較高特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠滿足直接與載體同源重組的需要，并以大小片段1.5︰1的比例先進(jìn)行混合，從而增加2個(gè)基因融合的成功率。應(yīng)用SOE PCR進(jìn)行片段連接的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，嵌合引物要求具有相近的退火溫度，序列長(zhǎng)度在50～70 bp，而且重疊部分的序列要達(dá)到一定的長(zhǎng)度，會(huì)增加融合的成功幾率[15]。本研究設(shè)計(jì)的4條嵌合引物中1NR、2DR長(zhǎng)度為69 bp，1DF、2NF長(zhǎng)度為57 bp，重疊部分長(zhǎng)度為20 bp，互補(bǔ)序列可以滿足將2個(gè)基因融合在一起的需要。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良作物品質(zhì)近些年已成為熱點(diǎn)研究問(wèn)題，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，單基因轉(zhuǎn)化技術(shù)已不能滿足人們對(duì)作物改良的需要。更多的研究者將研究方向轉(zhuǎn)向研究參與某個(gè)代謝途徑的多個(gè)基因在植物體中共同表達(dá)，通過(guò)對(duì)多基因調(diào)控來(lái)獲取更好的作物目的性狀。新興的以2A肽連接的基因融合方法，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、自剪切高效的優(yōu)點(diǎn)，適用于探討多基因在某一代謝功能中相互作用的規(guī)律[16]。本研究利用前期克隆的ScNAC1和ScDREB抗旱基因構(gòu)建多基因表達(dá)整體，后期將通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷，并結(jié)合單個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以探討上述2個(gè)基因在甘蔗再生植株中的表達(dá)規(guī)律及互作效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物利用SOE PCR方法將ScNAC1、SCDREB基因進(jìn)行融合，并通過(guò)同源重組的方法連接植物表達(dá)載體，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了p1300:ScNAC1:2A:ScDREB、p1300:ScDREB:2A:ScNAC1融合基因表達(dá)載體。