細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EgM123蛋白融合霍亂毒素B亞單位疫苗的構(gòu)建表達(dá)及免疫原性研究

齊文靜1,，何 黎，王 甜，鄭雪婷，郭寶平，張文寶，況 玲1，李 軍

包蟲(chóng)(棘球蚴)病是由棘球絳蟲(chóng)的中絳期幼蟲(chóng)寄生在體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重危害人畜健康的人獸共患病。其中，由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcosisgranulosa，E.g)引起的棘球蚴病稱作囊型棘球蚴病(Cystic Echinococcosis，CE)，可引起人體內(nèi)嚴(yán)重病變，呈世界性分布[1]。我國(guó)是包蟲(chóng)病高發(fā)區(qū)[2-3]，已證實(shí)25個(gè)省、市和自治區(qū)流行棘球蚴病，其中，甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、青海、四川、陜西和西藏流行嚴(yán)重，嚴(yán)重影響我國(guó)農(nóng)牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和群眾健康[4-5]。

E.g的生活史需要兩種宿主參與完成，中間宿主為食草動(dòng)物類，其幼蟲(chóng)寄生于動(dòng)物臟器內(nèi)；而終末宿主為犬等食肉動(dòng)物，其成蟲(chóng)寄生在犬的小腸內(nèi)。成蟲(chóng)在終末宿主犬體內(nèi)發(fā)育45 d后成熟，其蟲(chóng)卵隨糞便排出，污染食物和飲水，被中間宿主或人攝入后感染發(fā)病[6]，病原如此往復(fù)循環(huán)于食肉和食草動(dòng)物之間。在包蟲(chóng)病流行地區(qū)，犬的感染數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于綿羊，免疫犬是理想的控制方法。目前關(guān)于犬的保護(hù)性疫苗已有了一定的研究，Zhang等[7]人利用差異顯示PCR技術(shù)從E.g成熟成蟲(chóng)發(fā)育階段中分離出EgM4、EgM9和EgM123成蟲(chóng)特異基因片段；用EgM123-GST重組蛋白免疫犬，經(jīng)原頭節(jié)攻擊感染，取得了減蟲(chóng)和抑制成蟲(chóng)發(fā)育的保護(hù)效果，表明EgM123有望成為犬疫苗研制的重要保護(hù)性抗原[8]。王慧等[9]已成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-EgM123，并且在大腸桿菌中成功獲得誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)Western-blotting方法鑒定了該融合蛋白的免疫活性。

霍亂毒素B亞單位(CTB)為霍亂毒素的無(wú)毒亞單位，它可作為免疫佐劑和輸送抗原的載體，已經(jīng)有研究證明將其與目的抗原偶聯(lián)或表達(dá)成融合蛋白后，可使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和局部黏膜免疫應(yīng)答[10-11]。

本研究主要以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EgM123融合霍亂毒素B亞單位載體來(lái)構(gòu)建亞單位疫苗，并在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)ELISA和Western-blotting鑒定了該融合蛋白的免疫原性；免疫小鼠和犬后發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生高水平的抗體，同時(shí)可激活腸道產(chǎn)生黏膜免疫，為包蟲(chóng)病疫苗的研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物室(AAALAC認(rèn)證)根據(jù)國(guó)家科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》飼養(yǎng)。1～3歲比格犬購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前糞樣及血清檢測(cè)為陰性，在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物隔離室觀察1周。

1.1.2質(zhì)粒與菌種 CTB序列及引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，表達(dá)載體pET-28a(+)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，大腸桿菌E.coli(BL21)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.1.3主要試劑 T4 DNA連接酶、DNA Marker、PCR試劑、限制性內(nèi)切酶NheI、BamHI和XhoI均購(gòu)自日本TaKaRa公司；IPTG購(gòu)自Promega公司；兔抗EgM123-GST血清由本室保存；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，羊抗鼠IgG、IgG2a、IgA抗體，以及羊抗犬IgG抗體均購(gòu)自Bethyl Lab；其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1原核表達(dá)載體pET28a/CTB的構(gòu)建 根據(jù)原核表達(dá)載體pET28a上的多克隆位點(diǎn)，在pET28a載體上引入CTB序列，具體過(guò)程為：人工合成CTB序列，兩端分別帶有酶切位點(diǎn)NheI(5′GCTAGC3′)和BamHI(5′GGATCC3′)；然后將經(jīng)NheI和BamHI酶切后CTB序列與經(jīng)相同酶切后的pET28a載體的骨架大片段相連構(gòu)建pET28a/CTB質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。將連接產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確后得到中間載體pET28a/CTB。

1.2.2EgM123基因的克隆及鑒定 根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的EgM123基因編碼序列的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成特異性引物用于擴(kuò)增EgM123目的基因片段。在上、下游引物的5′端分別引入了一個(gè)酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI。引物序列為：

Primer-F1(下劃線部分為BamHI的識(shí)別序列)：

5′-GCGGATCCATGGAACCAGTGAATTTTGCCTGCCC-3′；

Primer-R1(下劃線部分為XhoI的識(shí)別序列)：

5′-CCCTCGAGTTTCGTCTTTAAGGCACGAAACAACTTGAAAAGC-3′。

引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA(提取成蟲(chóng)總RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA)為模板擴(kuò)增EgM123基因片段。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.3pET28a/CTB-EgM123重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將純化后的EgM123 PCR產(chǎn)物和中間載體pET28a/CTB分別經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切之后回收，連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化菌涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)板，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑取經(jīng)PCR方法初篩得到的陽(yáng)性菌株送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4pET28a/CTB-EgM123融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)存正確的陽(yáng)性克隆，接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，220 r/min振蕩搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。按照1%體積將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液接種于含相同濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，220 r/min振蕩搖床中培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6左右，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h、3 h、4 h、5 h時(shí)收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

將菌液培養(yǎng)物于4 ℃，4 000 r/min，離心15 min，收集細(xì)菌沉淀。將菌體在液氮-室溫環(huán)境中凍融3次。用預(yù)冷的Binding Buffer緩沖液(pH7.4)重懸菌體沉淀，先用高壓細(xì)胞破碎儀(FPG12800，STANSTED)高壓破碎菌體重懸液，再用超聲儀破碎裂解物(功率400 W，時(shí)間5 s，間歇5 s，總時(shí)長(zhǎng)為2 min)。然后在4 ℃，12 000 r/min，離心60 min。離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(配制5%濃縮膠，12%分離膠，20 mA恒流電泳約1 h，用0.1%考馬斯亮藍(lán)染色2 h，然后脫色至本底無(wú)色為止)。分析檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，同時(shí)在表達(dá)過(guò)程中收集的誘導(dǎo)前菌液作為未誘導(dǎo)對(duì)照。

1.2.5CTB-EgM123融合蛋白的純化與復(fù)性 按照1.2.4的表達(dá)方法大量誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，離心菌液，棄掉上清，將菌體沉淀用不含尿素的Binding Buffer緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L PB，pH7.4)重懸，用細(xì)胞破碎儀及超聲儀破碎菌體沉淀。先用PBS將處理好的菌體沉淀洗10次，前5次，4 ℃，10 000 r/min離心10 min；后5次，4 ℃，5 000 r/min離心10 min。再用Buffer 1(50 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，8 mol/L Urea，10 mmol/L Imidazole，pH7.4)對(duì)洗好的沉淀進(jìn)行溶解，完全溶解后，4 ℃，10 000 r/min，離心30 min，上清用0.45 μmol/L的濾膜過(guò)濾后進(jìn)行純化復(fù)性。

將1 mL的鎳螯合組氨酸柱子用10倍柱體積Buffer 1進(jìn)行平衡；將已處理好的蛋白裂解液，加到柱子中；等蛋白與樹(shù)脂結(jié)合后，用10倍體積的Buffer 1沖洗柱子，洗去未結(jié)合上的蛋白及雜蛋白；以60倍柱體積的Buffer 1和Buffer 2(50 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Imidazole，pH7.4)按照一定的體積與流速，將尿素從8 M替換為0 M進(jìn)行復(fù)性；再以10倍體積的Washing Buffer 1(50 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole，pH7.4)沖洗鎳柱；最后以5倍柱體積的Buffer 3(50 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，1 mol/L Imidazole，pH7.4)洗脫收集目的蛋白(AKTA PURE)。

1.2.6Western-blotting檢測(cè)融合蛋白 采用Western-blotting法將未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a-CTB-EgM123菌液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(電泳條件：80 V，2 h)，將PVDF膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中于37 ℃封閉1 h；用PBST洗3次，每次5 min；將PVDF膜浸泡于重組EgM123-GST抗原免疫的兔血清 (1∶400稀釋)中，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；二抗為羊抗兔的IgG-HRP(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min，以4-氯-1萘酚顯色，用PBS終止反應(yīng)。

1.2.7CTB-EgM123融合蛋白的生物活性分析

1.2.7.1融合蛋白免疫小鼠- ELISA檢測(cè)血清效價(jià)及抗體亞類 將BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分組，每組10只，分別為CTB-EgM123蛋白，EgM123蛋白和PBS對(duì)照組，蛋白抗原免疫劑量為25 μg/只/次，每只小鼠免疫100 μL。間隔兩周免疫1次，共免疫3次。第1 次免疫用弗氏完全佐劑，后 2 次加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫，每次免疫前和免疫后2周小鼠尾靜脈采血并分離血清用于檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)特異抗原EgM123特異性IgG抗體效價(jià)。

腸黏液的制備：稱取相同重量的5 g小腸組織，縱向剖開(kāi)小腸，刮取黏膜放入1.5 mL EP管中，加0.5 mL體積的PBS于腸黏液中，用攪拌器快速攪拌，3 000 g離心10 min，分離上清，用于檢測(cè) EgM123特異性IgA抗體。

用ELISA方法檢測(cè)免疫6周后小鼠血清中IgG抗體效價(jià)。以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)特異表達(dá)EgM123為抗原，濃度為0.5 μg/mL進(jìn)行包被，100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次；用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，PBS洗3次；以待測(cè)小鼠血清為一抗，37 ℃孵育1h，PBST洗3次；以1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP及其亞類為二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次；加入底物ABTS顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD405值。

用相同ELISA方法檢測(cè)小鼠腸黏液中IgA抗體。以小鼠腸黏液為一抗，羊抗鼠IgA-HRP為二抗，稀釋度為1∶10 000。

1.2.7.2融合蛋白免疫犬- ELISA檢測(cè)血清效價(jià) 隨機(jī)將比格犬分組，每組10只，分別設(shè)CTB-EgM123蛋白與EgM123蛋白免疫組及PBS對(duì)照組，免疫劑量為100 μg/只犬/次，間隔兩周免疫1次，以相同劑量的Quil A為佐劑充分混合均勻后進(jìn)行免疫。采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫。免疫前和免疫后2周采血，分離血清，用于檢測(cè)EgM123特異性IgG抗體效價(jià)。

用與鼠相同的ELISA方法檢測(cè)免疫3次后犬血清中特異性IgG抗體效價(jià)。以不同稀釋度的犬血清為一抗，羊抗犬IgG-HRP按1∶10 000稀釋為二抗，用相同ELISA方法檢測(cè)0～8周犬血清中特異性IgG抗體水平。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0與GraphPad5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)分析與作圖。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以CTB、EgM123、CTB-EgM123等質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在200～500 bp，>500 bp，750～1 000 bp之間有清晰的DNA條帶，與預(yù)期目的基因大小(201 bp，603 bp和804 bp)一致(圖1)。將CTB-EgM123的測(cè)序結(jié)果與GenBank中EgM123 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果為100%同源(圖2)，表明CTB-EgM123基因序列正確，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：CTB PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2：EgM123 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3：CTB-EgM123 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 CTB、EgM123、CTB-EgM123基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of CTB，EgM123，CTB-EgM123 gene

2.2CTB-EgM123融合蛋白的誘導(dǎo) 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒CTB-EgM123轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)0.4 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎、離心。然后分別對(duì)誘導(dǎo)2 h、3 h、4 h、5 h的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示與未誘導(dǎo)菌相比，2 h～5 h內(nèi)誘導(dǎo)菌的沉淀在35 kDa～50 kDa之間有明顯差異表達(dá)的蛋白條帶(圖3A)，與目的蛋白的預(yù)測(cè)值37 kDa相一致。表達(dá)菌體經(jīng)超聲破碎離心后發(fā)現(xiàn)，目的蛋白主要存在于沉淀中，說(shuō)明該融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(圖3A)。經(jīng)過(guò)鎳離子柱親和層析的方法進(jìn)行純化復(fù)性后，得到純度較高的CTB-EgM123蛋白(圖3B)。

圖A：融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) M：標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：CTB-EgM123轉(zhuǎn)化BL21未誘導(dǎo)菌體蛋白沉淀；2，4，6，8：分別為CTB-EgM123轉(zhuǎn)化BL21誘導(dǎo)菌體蛋白2，3，4，5 h的上清；3，5，7，9：分別為CTB-EgM123轉(zhuǎn)化BL21誘導(dǎo)菌體蛋白2，3，4，5 h的沉淀圖B：融合蛋白的純化 M：標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：CTB-EgM123蛋白純化結(jié)果。圖3 SDS-PAGE 檢測(cè)CTB-EgM123 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化Fig.3 SDS-PAGE showing the expression of CTB-EgM123 protein induced by IPTG

2.3CTB-EgM123融合蛋白的免疫原性鑒定 將誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a/CTB-EgM123菌液沉淀、PET28a裂解液以及CTB-PET28a裂解液經(jīng)Western-blotting分析鑒定，同時(shí)使用兔抗EgM123抗體和正常兔血清做對(duì)比，結(jié)果表明CTB-EgM123 蛋白與兔抗EgM123抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，且條帶位置與SDS-PAGE一致而其他蛋白則不被識(shí)別，說(shuō)明CTB-EgM123是我們需要表達(dá)的功能蛋白(圖4)。

圖2 CTB-EgM123基因序列與已發(fā)表的EgM123基因序列同源性比較Fig.2 Alignment of EgM123 from cloned CTB-EgM123 and EgM123 cDNA published sequences

圖A：SDS-PAGE 圖B：一抗為正常兔血清 圖C：一抗為兔抗EgM123血清M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1：PET28a裂解液； 2：CTB- PET28a裂解液； 3：CTB-pET28a-EgM123蛋白圖4 Western-blotting 分析CTB-EgM123 蛋白的活性 Fig.4 Western-blotting analyze the activity of CTB-EgM123 protein

2.4CTB-EgM123融合蛋白免疫小鼠的抗體效價(jià) 檢測(cè)免疫6周后，免疫小鼠血清效價(jià)。與正常小鼠血清相比，CTB-EgM123與EgM123蛋白免疫后的小鼠血清抗體效價(jià)可達(dá)到1∶320 000以上。但兩組蛋白所產(chǎn)生的抗體滴度在1∶80 000之前，CTB-EgM123免疫組的血清效價(jià)高于EgM123免疫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.031 9，P<0.05(圖5)。說(shuō)明CTB具有增強(qiáng)EgM123蛋白的免疫原性作用，顯示其具有佐劑活性。

圖5 ELISA檢測(cè)CTB-EgM123與EgM123免疫小鼠6周后血清中IgG抗體效價(jià)Fig.5 ELISA determining the titer of IgG antibody in the sera of mice after 6 weeks of immunization

檢測(cè)CTB-EgM123與EgM123融合蛋白免疫6周后，小鼠腸黏液中IgA抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTB-EgM123免疫組其腸黏液中IgA抗體反應(yīng)比PBS組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=0.041 0，P<0.05；EgM123免疫組其腸黏液中IgA抗體反應(yīng)同樣比PBS組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=0.000 6，P<0.05；而CTB-EgM123免疫組的IgA抗體水平雖然高于EgM123免疫組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=0.462 2，P>0.05(圖6)。說(shuō)明CTB-EgM123具有腸粘膜免疫應(yīng)答性。

檢測(cè)CTB-EgM123與EgM123融合蛋白免疫小鼠后0～6周其血清中抗體亞類，將免疫血清按照1∶10 000進(jìn)行稀釋，發(fā)現(xiàn)CTB-EgM123與EgM123蛋白免疫小鼠組血清其IgG2a抗體反應(yīng)比PBS對(duì)照組高。雖然CTB-EgM123組IgG2a抗體反應(yīng)從第3周開(kāi)始低于EgM123組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.1633，P>0.05(圖7)。

圖6 ELISA檢測(cè)CTB-EgM123與EgM123免疫小鼠腸黏液中的抗體IgAFig.6 Intestinal mucosal IgA of mice vaccinated with CTB-EgM123 and EgM123 by ELISA

圖7 ELISA檢測(cè)0～6周內(nèi)CTB-EgM123與EgM123免疫小鼠血清的抗體亞類IgG2aFig.7 ELISA detection Antibody subclass IgG2a of mouse immune serum within 0-6 weeks

圖8 ELISA檢測(cè)CTB-EgM123與EgM123免疫犬6周后血清中IgG抗體效價(jià)Fig.8 ELISA detection the titer of IgG antibody in serum after 6 weeks of immunization

圖9 ELISA檢測(cè)0～8周內(nèi)CTB-EgM123與EgM123免疫犬血清的抗體IgGFig.9 ELISA detection IgG antibody of dog immune serum within 0-8 weeks

2.5CTB-EgM123融合蛋白免疫犬的抗體效價(jià) 用融合蛋白免疫犬后，測(cè)定犬免疫3次后血清中IgG抗體效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用CTB-EgM123與EgM123蛋白免疫犬之后，犬體內(nèi)均產(chǎn)生了良好的免疫效果。與對(duì)照組犬血清相比，CTB-EgM123蛋白免疫后的犬血清抗體效價(jià)可達(dá)到1∶64 000以上。CTB-EgM123免疫組的血清效價(jià)高于EgM123免疫組，在抗體效價(jià)<32 000時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.006 491，P<0.05(圖8)。檢測(cè)犬免疫0～8周之間血清中IgG抗體變化。將免疫血清按照1∶400進(jìn)行稀釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTB-EgM123與EgM123蛋白免疫組其犬血清中IgG抗體反應(yīng)從第4周開(kāi)始升高，與PBS組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為t=0.000 2及t=0.000 3，P<0.05(圖9)。其中，CTB-EgM123免疫組抗體反應(yīng)高于EgM123免疫組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.281，P>0.05(圖9)。同樣說(shuō)明CTB具有增強(qiáng)EgM123蛋白在犬體內(nèi)的免疫原性作用，顯示其具有佐劑活性。

3 討 論

犬是包蟲(chóng)病的傳染源，在包蟲(chóng)病傳染過(guò)程中具有重要意義。我們的前期研究證明，在成蟲(chóng)成熟期前對(duì)犬進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)，阻斷成蟲(chóng)向環(huán)境中排放蟲(chóng)卵，可以切斷傳染循環(huán)鏈，可使中間宿主免受感染，達(dá)到控制包蟲(chóng)病流行的目的[12]。在我國(guó)采取“犬犬投藥、月月驅(qū)蟲(chóng)”的無(wú)蟲(chóng)卵污染驅(qū)蟲(chóng)措施，可以阻斷病原的傳播[12]。但是高頻度的驅(qū)蟲(chóng)在牧區(qū)的執(zhí)行有很大的困難，若能對(duì)犬實(shí)施免疫接種預(yù)防，可以極大程度減少防控的工作量，加快包蟲(chóng)病的控制。保護(hù)性抗原的篩選對(duì)研制犬抗蟲(chóng)疫苗具有很大的影響，研究證明EgM123免疫犬，然后再用原頭節(jié)進(jìn)行攻擊感染，產(chǎn)生了一定的保護(hù)效果[8]。我們的前期研究證明重組EgM123蛋白能刺激犬產(chǎn)生抗體，但是抗體水平不能長(zhǎng)時(shí)間維持[13]。如何加強(qiáng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間高效價(jià)的抗體，是本研究的目的。

本研究試圖加入佐劑肽CTB與EgM123進(jìn)行融合，激發(fā)更高水平的抗原抗體反應(yīng)。但CTB的加入是否對(duì)EgM123蛋白的表達(dá)有影響，是否具有好的活性，是我們首先要解決的問(wèn)題。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，對(duì)EgM123的表達(dá)不產(chǎn)生影響。同時(shí)，融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)下2 h開(kāi)始產(chǎn)生高水平表達(dá)。通過(guò)對(duì)包涵體的復(fù)性處理，得到了可溶性的純化蛋白，免疫接種小鼠及犬均可產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明具有很強(qiáng)的免疫原性。

CTB作為免疫佐劑和輸送抗原的載體，將其與目的抗原偶聯(lián)或表達(dá)成融合蛋白后，可使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和局部黏膜免疫應(yīng)答。另外，融合蛋白可以極大程度降低佐劑的費(fèi)用。Dertzbaugh等[14]用鏈球菌糖基化轉(zhuǎn)移酶與CTB的融合蛋白，分別通過(guò)腹腔與口服途徑免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種途徑都能產(chǎn)生很高的血清IgG抗體。在本實(shí)驗(yàn)中，圖5及圖8結(jié)果說(shuō)明融合蛋白免疫小鼠和犬后均能產(chǎn)生高水平的IgG抗體，同時(shí)CTB-EgM123蛋白免疫小鼠及犬的血清效價(jià)均高于EgM123蛋白免疫小鼠和犬的血清效價(jià)，證明CTB具有誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫應(yīng)答作用，能加強(qiáng)EgM123蛋白的免疫原性，具有佐劑活性。

Tochikubo等[15]用牛血清白蛋白(BSA)與CTB的混合液，通過(guò)口服及鼻內(nèi)途徑免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)與口服免疫小鼠均可產(chǎn)生BSA特異性血清及IgA抗體應(yīng)答，而僅用BSA免疫的小鼠體內(nèi)則不會(huì)產(chǎn)生抗體應(yīng)答。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能證明CTB具有免疫佐劑活性，并可以增強(qiáng)蛋白的免疫原性。在本實(shí)驗(yàn)中，圖6結(jié)果表明CTB-EgM123蛋白免疫小鼠后，其腸黏液能產(chǎn)生一定水平的IgA抗體，并且高于EgM123免疫小鼠腸黏液產(chǎn)生的IgA抗體，表明CTB自身就具有免疫原性，與EgM123融合可以增強(qiáng)局部黏膜免疫。

對(duì)于CTB作為佐劑誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制和類型尚無(wú)定論。許多研究顯示CTB刺激的免疫反應(yīng)以Th2型為主[16-17]，亦有研究顯示以Th1型為主[18]，而有些則發(fā)現(xiàn)同時(shí)兼具Th1型與Th2型免疫應(yīng)答，這可能與共免疫抗原的性質(zhì)相關(guān)[19-20]。Coccia等[21]研究發(fā)現(xiàn)CTB可以抑制黏膜Th1細(xì)胞。Holmgren等[22]推測(cè)rCTB(重組CTB)可以刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖和分化，分泌Th2型細(xì)胞因子，同時(shí)還可以誘導(dǎo)局部黏膜免疫以及全身免疫。在本研究中，如圖7結(jié)果所示，ELISA檢測(cè)兩種蛋白免疫小鼠后血清產(chǎn)生的抗體亞類結(jié)果所示，在IgG2a抗體中發(fā)現(xiàn)CTB-EgM123組的抗體反應(yīng)略低于EgM123組。這與Coccia等的研究相一致{21}，CTB抑制了Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IgG2a抗體。

研究表明，犬抗細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的保護(hù)與體液的IgG成正相關(guān)[23]。在本實(shí)驗(yàn)中，用ELISA檢測(cè)免疫犬血清中的IgG抗體效價(jià)，結(jié)果如圖8所示，CTB-EgM123及EgM123蛋白都能刺激犬產(chǎn)生高水平的IgG抗體，并且CTB-EgM123蛋白的抗體效價(jià)顯著地高于EgM123蛋白，研究結(jié)果顯示CTB能加強(qiáng)EgM123蛋白的免疫效果，尤其是可以提高IgG的水平。同時(shí)與我們?cè)缙谘芯肯啾萚13]，CTB-EgM123蛋白免疫犬后，刺激機(jī)體產(chǎn)生有效性抗體的時(shí)間，能維持的更久。但是EgM123蛋白融合CTB后在犬的原頭蚴攻擊感染實(shí)驗(yàn)中，能否提高犬的保護(hù)性，我們將進(jìn)一步的開(kāi)展研究。

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增出大小為603 bp的EgM123基因片段，并將其連接到已構(gòu)建好的pET28a/CTB原核表達(dá)載體中，用IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET28a/CTB-EgM123在大腸桿菌BL21中的表達(dá)，Western blotting結(jié)果顯示正確表達(dá)了目的蛋白。純化及復(fù)性后得到了純度>95%的蛋白，用抗原免疫小鼠后能產(chǎn)生高水平抗原抗體反應(yīng)，可激活腸道局部粘膜特異性的IgA反應(yīng)；用抗原免疫犬不僅產(chǎn)生了高水平的抗體，而且相對(duì)于EgM123能提高抗體水平。因此該融合蛋白可作為包蟲(chóng)病候選疫苗進(jìn)行更深一步研究。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：齊文靜，何黎，王甜，等.細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EgM123蛋白融合霍亂毒素B亞單位疫苗的構(gòu)建表達(dá)及免疫原性研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2019，35(7)：647-654. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.087