兔脛骨橫向搬移系統(tǒng)的研制及其在實驗研究中的應用

韋積華，唐乾利，羅群強，唐毓金，莫雄革，陳戟霞，周傳曉

(1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，廣西 百色 533000;

2.右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000)

脛骨橫向搬移技術或稱Ilizarov微循環(huán)重建技術是基于Ilizarov張力-應力法則開發(fā)出來的治療下肢缺血性疾病的技術。近年來，有學者報道采用該技術治療糖尿病足潰瘍[1-2]及下肢慢性缺血性疾病[3]取得了良好的臨床療效。隨著研究的深入，越來越多的臨床研究見諸報道，已有學者將Ilizarov微循環(huán)重建技術應用在神經(jīng)再生、關節(jié)軟骨再生及骨性關節(jié)炎方面[4-6]。目前對Ilizarov微循環(huán)重建技術的研究多從血管造影、彩色多普勒超聲進行，而對于血管再生及血管重塑的機制研究鮮見，更多的、更深入的基礎研究很有必要，因此，開發(fā)動物實驗用的脛骨橫向搬移系統(tǒng)用于Ilizarov微循環(huán)重建技術的基礎研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用6月齡健康新西蘭兔4只，購自右江民族醫(yī)學院動物實驗中心(編號：45003600000148)，體重約2000～2500 g，在右江民族醫(yī)學院動物實驗操作室進行實驗操作，常規(guī)飲食，光照保持晝夜節(jié)律各12 h，溫度控制在24～26℃，相對濕度控制在50%～70%，并按照實驗動物的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 實驗藥物 戊巴比妥鈉，規(guī)格：5克/瓶(上海榕柏生物技術有限公司);0.9%NaCl注射液，規(guī)格：100毫升/瓶(石家莊制藥四廠);慶大霉素注射液，規(guī)格：8萬U/瓶(河南潤弘制藥股份有限公司);青霉素鈉，規(guī)格：40萬U/瓶(安徽豐原制藥股份有限公司淮海藥廠);四氧嘧啶，規(guī)格：5克/瓶(合肥博美生物科技有限責任公司);無水乙醇(上海生工生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);蘇木精(Sigma公司)。

1.1.3 實驗設備 電鉆(杭州億凡醫(yī)療器械有限公司);克氏針，規(guī)格1.0(深圳市鑫鈺金屬材料有限公司);U型鋁材，規(guī)格U型槽6 mm×10 mm×1 mm，內(nèi)徑4.4 mm(上海勝捷鋁業(yè)有限公司);螺釘，規(guī)格M2×25(博奧公司);CX-41型雙目顯微鏡(Olympus公司);數(shù)碼相機505D(佳能)。

1.2 實驗方法

1.2.1 脛骨橫向搬移系統(tǒng)的設計及應用

1.2.1.1 整體結構及分析 脛骨橫向搬移系統(tǒng)由U形鋁合金支架、2枚固定螺釘、1枚脛骨橫向搬移螺釘和1枚旋轉螺母四部分組成(見圖1a)。U形鋁合金支架與兩枚全螺紋螺釘連接并由兩枚螺帽固定，兩枚全螺紋螺釘置入脛骨，起到固定支架的作用。1枚脛骨橫向搬移螺釘從U形鋁合金中間穿過，通過U形槽內(nèi)的一枚旋轉螺母可朝正反兩個方向橫向搬移脛骨骨塊。

1.2.1.2 器械規(guī)格 脛骨橫向搬移系統(tǒng)全長350 mm，寬10 mm，高6 mm;2枚固定螺釘及1枚脛骨橫向搬移螺釘規(guī)格均是2 mm×250 mm;橫向搬移最大值為10 mm，旋轉螺母每旋轉2圈脛骨塊向外搬移0.125 mm，誤差1/100。全套系統(tǒng)總重量為4.5 g。

1.2.1.3 器械材質(zhì) 經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)成年新西蘭兔脛骨的長度為80～100 mm，脛骨上段直徑為8～10 mm，皮質(zhì)骨厚度為0.8～1 mm，故在選用牽引的材質(zhì)時考慮質(zhì)量要輕、硬度足夠，并且易于成型。本系統(tǒng)支撐架選用7075T6鎂鋁合金制作，固定用全螺紋螺釘、橫向牽引螺釘均為304型不銹鋼制作，調(diào)節(jié)螺母使用輕質(zhì)塑料。

1.2.2 模型實驗 先在兔的脛骨上安裝脛骨橫向搬移系統(tǒng)測試其性能。取兔脛骨一根，在脛骨上段安裝該系統(tǒng)，截取長8～10 mm，寬5～7 mm的骨塊，在骨塊內(nèi)擰入1枚2 mm全螺紋螺釘，用于橫向搬移骨塊(見圖1b、圖1c)。

圖1 在兔的脛骨上安裝橫向搬移系統(tǒng)

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 術前準備 術前禁食、禁水8 h。2%戊巴比妥鈉麻醉，備8萬個單位慶大霉素用250 ml生理鹽水稀釋，用于沖洗傷口。脛骨橫向搬移系統(tǒng)經(jīng)高溫消毒。

1.2.3.2 手術步驟 用2%戊巴比妥鈉以30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉。麻醉生效后取仰臥位固定后，常規(guī)消毒鋪巾。在無菌條件下，在左小腿上段前內(nèi)側作縱切口，切開皮膚，充分暴露脛骨上段前面，確定脛骨搬移骨塊的范圍，長8～10 mm，寬5～7 mm，在骨塊內(nèi)擰入1枚2 mm全螺紋螺釘，用于向外搬移骨塊，用直徑1.0 mm克氏針在預定搬移骨塊的邊緣鉆孔分離需搬移的骨塊，分離骨塊時注意不要損傷髓腔內(nèi)骨髓。在骨塊近、遠端脛骨側各擰入1枚直徑2 mm的外固定螺釘，安裝調(diào)整脛骨搬移架，搬移架底面距離皮膚7 mm，標記骨搬移方向，用慶大霉素加250 ml生理鹽水沖洗創(chuàng)口后全層縫合傷口。

1.2.3.3 術后處理 術后連續(xù)3 d肌注青霉素，40萬單位/天，術口每天以碘伏消毒2次，分籠飼養(yǎng)。術后第4 d開始實施脛骨橫向搬移，每天向外搬移0.5 mm，分2次完成，旋轉2圈為0.125 mm，0.25毫米/次，1次/12小時，2次/天，共7 d完成，向外搬移3.5 mm。接著每天按相反的方向往回搬移0.5 mm，每天2次，共7 d完成 (手風琴技術)，將脛骨骨塊搬移回原位后維持2周后拆除支架。橫搬后第7 d進行X線檢查了解該骨橫搬的效果。

1.2.4 動物實驗

1.2.4.1 動物分組 將24只新西蘭兔按隨機數(shù)字表法分為：空白對照組、模型組、貝復新組、Ilizarov組，每組6只。飼養(yǎng)環(huán)境同1.1.1，動物在實驗前在動物房環(huán)境中適應6 d。

1.2.4.2 糖尿病足潰瘍模型建立 模型組、貝復新組及Ilizarov組采用Tan及孟建波等[7-8]糖尿病足潰瘍的建模方法。兔糖尿病模型的制備：將1 g四氧嘧啶溶于10 ml雙蒸水中，配置成100 mg/ml的水溶液，并用微孔濾膜過濾除菌。新西蘭兔禁食12 h后，于耳緣靜脈注射上述配置后的四氧嘧啶水溶液150 mg/kg。分別于造模前1 d以及造模后48 h、1周、4周采集空腹耳緣靜脈血，以快速血糖儀測定血糖。1周后測空腹血糖＞15 mmol/L，認為糖尿病造模成功[7]。糖尿病足創(chuàng)面模型的建立：麻醉方法同1.2.3.2。用電動剃刀剃除右側后肢股內(nèi)側毛發(fā)，消毒手術野，做縱行切口，暴露股動脈血管鞘，仔細分離股動脈及其分支并結扎離斷，縫合皮下組織及皮膚。將動物置于28～30℃環(huán)境中，自然復蘇后，自由飲食，術后3 d內(nèi)應用青霉素預防傷口感染，傷口每日以碘伏消毒換藥。2周后采用局部麻醉，用直徑1.0 cm的圖章標記造模面積，在無菌條件下，用外科方法在足背作深達筋膜、直徑為2.0 cm的全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面，然后加蓋一層消毒凡士林油紗布及兩層消毒干紗布，建成糖尿病足創(chuàng)面模型?？瞻讓φ战M僅建立面積大小相同的足部急性創(chuàng)面模型。

1.2.4.3 各組干預方法 ①空白對照組：僅建立急性創(chuàng)面模型，創(chuàng)面外敷單層生理鹽水紗布，然后在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布。②模型組：換藥方法同空白對照組。③貝復新組：創(chuàng)面消毒后涂上一層重組牛堿性生長因子，創(chuàng)面外敷一層消毒凡士林油紗布及兩層消毒干紗布，膠布固定。④Ilizarov組：脛骨橫向搬移架的安裝方法同1.2.2。術后第4 d開始搬移骨塊，每天向外搬移0.5 mm，分2次完成，旋轉2圈為0.125 mm，0.25毫米/次，每隔12 h向外搬移1次，每天向外搬移2次，共7 d完成，向外搬移3.5 mm。向外搬移結束后第2 d以同樣的方法往回搬移骨塊，共7 d完成往回脛骨橫搬 (手風琴技術)，將脛骨塊搬移回原位后維持2周后拆除脛骨搬移架。足部創(chuàng)面加蓋一層消毒凡士林油紗布及兩層消毒干紗布，膠布固定。

1.2.4.4 創(chuàng)面愈合分析 肉眼觀察創(chuàng)面的愈合情況，并分別在造模后第0 d、7 d、14 d、21 d以固定焦距對創(chuàng)面進行拍照。使用NIH Image J圖像分析軟件進行創(chuàng)面面積測量分析，計算創(chuàng)面的愈合百分率。計算公式：創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.4.5 取材與樣品處理 造模成功，干預后第7d取各組新西蘭兔創(chuàng)面相同部位的肉芽組織，深達筋膜層用于血管計數(shù)，予濾紙包裹置于包埋盒進行免疫組化處理：①二甲苯脫蠟，梯度酒精復水：二甲苯Ⅰ20 min—二甲苯Ⅱ20 min—100%乙醇Ⅰ5 min—100%乙醇Ⅱ5 min—95%乙醇5 min—80%乙醇5 min—PBS洗3×3 min;②阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育15 min，PBS沖洗3×3 min;③ 抗原修復：置0.01 M枸櫞酸緩沖液(p H 6.0)中水煮修復10 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3×3 min;④滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，轉至室溫平衡30 min，PBS沖洗3×5 min;滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;⑤DAB反應染色，顯微鏡下觀察反應進度，自來水充分沖洗;⑥蘇木素復染，干燥，封片，拍照。顯微鏡觀察陽性血管數(shù)目：選擇損傷處區(qū)域計數(shù)，每個樣本選擇5個視野，創(chuàng)面選5個視角拍攝，200×鏡下計數(shù)陽性血管數(shù)目。NIH Image J圖像分析軟件進行陽性染色血管計數(shù)。三位經(jīng)驗豐富實驗人員分別測量，以盡量減小誤差，結果以±s)表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以±s)表示，多個樣本間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔脛骨橫搬系統(tǒng)的安裝效果 通過脛骨上段骨橫搬動物模型的建立，自行設計的脛骨橫搬系統(tǒng)可被較容易地安裝于兔脛骨上段，手術時間：(18.2±4.5)min。將兔脛骨骨塊向外搬移了(3.1±0.2)mm，并能按原位往回搬移，見圖2。

圖2 兔脛骨橫搬系統(tǒng)的安裝效果

2.2 創(chuàng)面愈合率 造模后分別拍攝0 d、7 d、14 d和21 d照片，計算每個時相點的創(chuàng)面愈合率。與空白對照組比較，模型組、Ilizarov組和貝復新組創(chuàng)面愈合較慢;與模型組比較，Ilizarov組和貝復新組愈合相對較快，模型組創(chuàng)面潰爛，2周左右才開始結痂，恢復最慢;Ilizarov組與貝復新組比較，在潰瘍的早期貝復新組愈合快于Ilizarov組，中晚期Ilizarov組快于貝復新組。各組之間愈合率比較：第7 d，各組之間的愈合率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);第14 d，Ilizarov組、空白對照組明顯快于貝復新組及模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，Ilizarov組和空白對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);第21 d，模型組與其他三組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，余各組之間的愈合率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 不同時相點各組兔創(chuàng)面愈合率 ±s，%)

表1 不同時相點各組兔創(chuàng)面愈合率 ±s，%)

注：與模型組比較，a：P＜0.01;與空白對照組比較，b：P＜0.01;與貝復新組比較，c：P＜0.01

組別 n 第7 d 第14 d 第21 d空白對照組 6 75.26±7.99 98.00±1.38ac 98.10±1.20a模型組 6 64.70±14.87 86.12±6.00 90.28±4.10貝復新組 6 69.77±5.77 87.25±2.81b 98.28±1.23a Ilizarov組 6 72.20±7.40 94.70±1.20ac 97.28±1.89a F 0.001 1.381 16.883 17.995 P 0.278 ＜0.001 ＜

2.3 血管再生效果 在干預后第7 d各組新西蘭兔創(chuàng)面在200×鏡下計數(shù)陽性血管數(shù)目。第7 d，Ilizarov組、空白對照組及貝復新組陽性血管數(shù)量均多于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，陽性血管數(shù)量：空白對照組＞Ilizarov組＞貝復新組＞模型組，見表2。CD31陽性呈黃棕色，表達于血管內(nèi)皮細胞，如紫色箭頭所示，見圖3。

表2 第7 d顯微鏡觀察各組陽性血管數(shù) ±s)

表2 第7 d顯微鏡觀察各組陽性血管數(shù) ±s)

注：與模型組比較，a：P＜0.01，b：P＜0.05;與空白對照組比較，c：P＜0.01

組別 n 陽性血管數(shù)空白對照組 6 51.1±12.6a模型組 6 10.3±4.2貝復新組 6 19.3±4.4bc Ilizarov組 6 23.7±6.6ac F 0.001 30.098 P＜

3 討論

Ilizarov牽張成骨技術發(fā)明的初期階段，主要應用于四肢骨骼方面的病變，如：骨折、骨不連、骨缺損、慢性骨髓炎和肢體畸形，后期逐漸擴展至軟組織畸形與頜面畸形的矯形與功能重建。隨著大量的臨床實踐及基礎研究的深入開展，發(fā)現(xiàn)該技術通過給骨骼一個合適的牽張引力，能夠調(diào)動機體的自然修復潛能，使骨骼及其附著的肌肉、筋膜、血管和神經(jīng)同步生長[9-10]，從而實現(xiàn)受損組織微循環(huán)的重建。Ilizarov微循環(huán)重建技術不僅是對顯微外科技術的一種拓展，而且在治療微循環(huán)障礙性疾病方面也取得了突破性的進展，由此，郭保逢等[11]將后Ilizarov技術在微循環(huán)障礙性疾病領域的應用稱之為“后Ilizarov時代的微循環(huán)重建術”。臨床實踐上，花奇凱等[3，12]在利用Ilizarov脛骨橫向骨搬移技術治療糖尿病、血栓閉塞性脈管炎及動脈硬化性閉塞癥所引起的慢性潰瘍方面取得良好的臨床效果，有效地挽救了許多瀕臨截肢的患者的肢體。其主要原理是通過骨搬移使骨搬移遠端的組織微循環(huán)得到有效的改善，從而促進了缺損組織的再生，實現(xiàn)了組織的自然重建。

圖3 第7 d各組免疫組化圖片

目前，在動物實驗研究方面已有股骨及脛骨縱向牽張器制作成功的報道[13-14]，研發(fā)脛骨橫向牽張器用于微循環(huán)重建技術的基礎研究十分必要。本文作者開發(fā)研制的實驗用兔脛骨橫向搬移系統(tǒng)具有如下特點：①符合Ilizarov骨橫搬的基本原理和規(guī)則;②安全有效地完成整個實驗過程;③取材及制作方便;④操作簡單;⑤價格便宜。

總之，此脛骨橫向骨搬移牽張器具有制作簡單、輕便易操作，價格低廉的特點，可有效實施脛骨上段橫向骨搬移實驗，適合科研人員在脛骨上段骨橫向搬移的實驗研究中應用。