miR-92b在子癇前期患者中的表達(dá)和意義

吳 穎,王 莉,葛 菲,溫云花,史 春

(1?？谑袐D幼保健院婦產(chǎn)科,海口 570203;2海南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:fenghuo58@163.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種在懷孕期間發(fā)生的綜合征,PE是孕產(chǎn)婦、新生兒和胎兒死亡的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn),胎盤血管形成障礙及母體內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致胎盤缺氧時(shí)產(chǎn)生的不同細(xì)胞因子可能是PE發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素[2]。目前,PE的致病分子機(jī)制尚未完全了解,因此難以監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展,微小RNA(microRNA,miRNA)可能是PE的潛在生物標(biāo)志物或有效治療靶點(diǎn)[3],可為嚴(yán)重子癇前期的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供信息,為PE的監(jiān)控和臨床管理提供了新的思路。miRNAs是一系列小的(18-24個(gè)核苷酸)內(nèi)源性非編碼單鏈RNAs,可通過非完全配對(duì)6-8個(gè)核苷酸,于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶mRNAs的表達(dá),目標(biāo)mRNA隨后通過形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物而降解,miRNA可以控制一系列不同的生物功能,包括細(xì)胞分化,增殖和凋亡[4-6]。在妊高征患者的胎盤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA的高表達(dá),表明它們可能在子癇前期中有其獨(dú)特的功能。這些miRNA包括miR-92b,miR-342-3p,miR-197,miR-25等[7,8],本研究擬使用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)在PE患者的血清中研究miR-92b的表達(dá)差異,并通過體外低氧模型的細(xì)胞增殖,探索細(xì)胞凋亡中miR-92b的表達(dá)及意義,為進(jìn)一步研究PE生物標(biāo)志物的病理生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及血清收集

選取2015-01～2017-12海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科招募的60名子癇前期孕婦為研究組,60名健康孕婦志愿者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡19-42歲,單胎妊娠,孕周35-40周。排除標(biāo)準(zhǔn):在簽署知情同意書前6個(gè)月內(nèi)患有腎病或原發(fā)性高血壓,有酒精或藥物濫用史,吸毒史的患者。每位入組者在首次入院時(shí)收集5 ml靜脈血。將血液吸入無(wú)抗凝血?jiǎng)┑臒o(wú)菌管中以收獲無(wú)細(xì)胞血清。試管保持靜置20 min后,在20 ℃和2 000 r/min下離心10 min,用移液管快速除去上清液,立即-80 ℃保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),研究前簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人絨毛膜癌(JAR)細(xì)胞系購(gòu)買自上海然泰生物科技有限公司。JAR細(xì)胞在含有高葡萄糖-Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基并補(bǔ)充有10%胎牛血清(Hyclone;GE Healthcare Life Sciences,Logan,UT,USA)和1%青霉素/鏈霉素(Mediatech,Inc)的培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基則置于5%CO2的潮濕氣氛的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。缺氧處理方法將單細(xì)胞懸浮液中并接種到96孔板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)后,使用AnaeroPack系統(tǒng)(Mitsubushi Gas Chemical America,Inc.,New York,NY,USA)誘導(dǎo)JAR細(xì)胞低氧模型[8],設(shè)置6個(gè)重復(fù),持續(xù)48 h,收集細(xì)胞記為缺氧組(n=6),同時(shí)收集未經(jīng)缺氧處理的JAR細(xì)胞,記為對(duì)照組(n=6),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 real-time PCR

使用TRIzol試劑提取研究組(n=60)和對(duì)照組(n=60)孕婦血清、對(duì)照組(n=6)和缺氧組(n=6)細(xì)胞總RNA,隨后用75%乙醇代替異丙醇進(jìn)行RNA沉淀。使用NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量。以DBI Bestar qPCR RT試劑盒(DBI Bioscience,Ludwigshafen,德國(guó))將總共1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用7500 Fast Real-Time PCR儀進(jìn)行RT-PCR,檢測(cè)血清和細(xì)胞中miR-92b的表達(dá)。20 μl PCR反應(yīng)包括1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1 ∶5),上下游引物各0.5 μl和10 μl DBI-2043Bestar?實(shí)時(shí)PCR主混合物。引物序列見表1。將反應(yīng)物在96孔光板中于94 ℃溫育2 min,然后進(jìn)行94 ℃ 20 s,8 ℃ 20 s和72 ℃ 20 s的40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt公式對(duì)miRNA進(jìn)行定量。

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primer sequences

基因引物序列miR-92b上游引物:5′-TATTGCACTCGTCCCGGCCTCC-3′下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用Lipofectamine 2000將miR-92b mimics及其相應(yīng)對(duì)照(上海吉瑪基因化學(xué)科技有限公司)轉(zhuǎn)染到缺氧預(yù)處理后的JAR細(xì)胞中,分別記為miR-92b mimics組(n=6)和control組(n=6),然后在37 ℃下在不含F(xiàn)BS的DMEM中孵育48,72,96 h。在各孔中加入100 μl Cell Counting Kit-8溶液(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Kumamoto,Japan),并在37 ℃下完成孵育1 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度(OD450 nm)以描述細(xì)胞增殖情況。

1.5 Western blot檢測(cè)cleaved caspase 3、Bcl2、Bax表達(dá)

在缺氧環(huán)境中對(duì)JAR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92b mimics及其相應(yīng)對(duì)照 48 h,分別記為miR-92b mimics組(n=6)和control組(n=6),提取兩組細(xì)胞的總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白與Loading buffer充分混合后100 ℃煮沸5 min變性,每孔50 μl加入到SDS-PAGE凝膠上樣孔中進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入按使用說(shuō)明稀釋后的待測(cè)一抗4 ℃過夜[待測(cè)一抗包括:cleaved caspase 3(1 ∶1 000)、Bcl2(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶1 500)]。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1 ∶1 000稀釋)。37 ℃孵育1 h,TBST清洗后以ECL發(fā)光液顯影,以自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,以GAPDH為內(nèi)參分析各蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

兩組入選者在年齡、體質(zhì)量、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間、尿素氮方面無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而子癇前期孕婦的收縮壓和舒張壓顯著高于對(duì)照組,生產(chǎn)時(shí)妊娠周數(shù)、肌酐、新生兒體質(zhì)量、24 h尿蛋白也明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 研究組與對(duì)照組臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

Table 2 Clinical features and laboratory examination results of the study group and the control group

臨床特征研究組(n=60) 對(duì)照組(n=60) P年齡(歲) 28.96±5.12 29.63±3.690.439體質(zhì)量(kg) 68.55±8.29 68.14±7.630.910體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2) 29.20±1.90 26.95±1.200.038確診PE時(shí)妊娠周數(shù)(周) 31.20±3.03 --生產(chǎn)時(shí)妊娠周數(shù)(周) 35.20±3.21 38.90±1.230.000收縮壓(mmHg) 156.12±11.35 114.90±9.350.000舒張壓(mmHg) 100.01±9.32 69.30±6.380.000凝血酶原時(shí)間(s) 11.35±0.61 11.52±0.900.493活化部分凝血活酶時(shí)間(s) 28.31±3.83 28.81±3.550.630凝血酶時(shí)間(s) 16.88±2.31 16.24±0.850.620血紅蛋白(g/L) 111.63±12.36 114.96±11.310.393尿素氮(mmol/L) 4.29±1.50 3.59±1.010.099肌酐(μmol/L) 58.26±16.34 42.29±6.620.000新生兒體質(zhì)量(g)2489.51±658.353270.00±392.230.00024 h尿蛋白(mg)2061.45±1960.13 109.31±39.20.000

2.2 研究組與對(duì)照組血清miR-92b水平比較

與對(duì)照組相比,研究組血清miR-92b表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

2.3 缺氧處理后JAR細(xì)胞miR-92b表達(dá)水平變化

缺氧處理后JAR細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,miR-92b表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.4 miR-92b對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以miR-92b mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48,72,96 h,JAR細(xì)胞在缺氧環(huán)境中細(xì)胞增殖均較轉(zhuǎn)染對(duì)照的control組明顯增加(P<0.05,見圖3)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05圖1 研究組與對(duì)照組血清miR-92b水平比較Figure 1 Comparison of serum mir-92b levels between study group and control group

與對(duì)照細(xì)胞對(duì)比,*P<0.05圖2 缺氧處理后JAR細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞miR-92b水平比較Figure 2 Comparison of mir-92b levels between hypoxic JAR cells and control JAR cells

與control組對(duì)比,*P<0.05圖3 miR-92b表達(dá)對(duì)JAR細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of mir-92b expression on the proliferation ability of JAR cells

2.5 miR-92b對(duì)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3、Bcl2/Bax表達(dá)的影響

缺氧環(huán)境中miR-92b mimics組JAR細(xì)胞較control組cleaved caspase 3、Bax表達(dá)降低、Bcl2表達(dá)增加(見圖4)。

圖4 miR-92b對(duì)凋亡蛋白cleaved-caspase 3、Bcl2/Bax的影響Figure 4 Effect of miR-92b on apoptotic protein cleaved-caspase 3, Bcl2/Bax

3 討論

導(dǎo)致子癇前期的分子機(jī)制尚不清楚。研究者們認(rèn)為,miRNA可能是潛在的子癇前期的生物標(biāo)志物,本研究驗(yàn)證了妊娠期間子癇前期患者與健康對(duì)照組血清miR-92b表達(dá)差異,隨后研究miR-92b對(duì)缺氧微環(huán)境下人絨毛膜癌細(xì)胞(JAR)增殖和凋亡的影響。PE患者中miR-92b的表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯降低,進(jìn)一步的研究證明,miR-92b mimics組缺氧微環(huán)境中JAR細(xì)胞的增殖能力增加,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3、Bax表達(dá)降低,抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)增加。本研究結(jié)果提示,高水平的miR-92b可以增加缺氧環(huán)境下細(xì)胞存活率,血清miR-92b表達(dá)缺失可能是PE發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物。

miR-92b的功能十分復(fù)雜,在惡性腫瘤中,miR-92b表達(dá)升高所造成的抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用可能是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的原因之一,因此,在子宮內(nèi)膜癌、胃癌、乳腺癌等實(shí)體瘤中常常出現(xiàn)miR-92b的異常表達(dá)[9,10]。但是在心血管疾病中,miR-92b的過表達(dá)對(duì)于心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用,減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡[11,12],在不同疾病中miR-92b表達(dá)的意義完全不同,本研究的結(jié)果支持miR-92b可能成為PE良好預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物的可能性,針對(duì)提高miR-92b的治療方法可能成為改善PE患者臨床結(jié)果的新方法。

miRNA通常靶向基因的3′非翻譯區(qū),并導(dǎo)致靶基因表達(dá)的降低或者喪失。在既往的研究中,有人提出fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)和胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor,PIGF)的比例可能是子癇前期的另一種診斷或預(yù)測(cè)工具[13,14]。薈萃分析顯示,母親出現(xiàn)子癇前期的孕婦胎盤sFlt1濃度升高,PIGF濃度降低。而且,發(fā)生嚴(yán)重子癇前期的女性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平明顯降低,胎盤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的缺氧性改變[15],miR-92b作為影響細(xì)胞缺氧抗性的miRNA,可能對(duì)sFlt-1或PIGF的表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。在PE期間miR-92b與上述mRNA的調(diào)控關(guān)系以及miR-92b可能的靶基因的尋找還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究表明在PE患者的臨床血清樣品中miR-92b的表達(dá)顯著下調(diào)。通過其特異性模擬物上調(diào)miR-92b,發(fā)現(xiàn)JAR細(xì)胞增殖能力增加,凋亡蛋白表達(dá)降低。miR-92b表達(dá)缺失可能在PE過程中調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡影響PE的發(fā)展和演進(jìn),外源性上調(diào)miR-92b可能是阻礙PE發(fā)生發(fā)展的可能途徑之一。