藏紅花素聯(lián)合順鉑通過抑制ERK信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡

許存庚,駱玉霜

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科,青海 810000;2青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

胃癌發(fā)病率在我國居于第二,胃癌早期患者臨床癥狀不明顯,診斷率較低,大多數(shù)患者中晚期確診,且經(jīng)手術(shù)切除治療后,仍有一部分患者死于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,病死率較高,嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。順鉑是胃癌晚期患者化療的基本藥物,抗癌作用較強(qiáng),但存在耐藥性,單獨(dú)使用有效率僅為20%[2]。藏紅花為臨床常用跌打損傷藥物,研究顯示其粗提取物藏紅花素有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,對血液腫瘤、軟組織腫瘤以及其他惡性腫瘤均具有較強(qiáng)的抑制作用,且毒副作用較弱,與化療藥物聯(lián)合后可提高療效[3,4]。本研究通過體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC-823并給予藏紅花素聯(lián)合順鉑處理,以探究藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及可能的作用機(jī)制,為胃癌的治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

胃癌細(xì)胞BGC-823購于中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所,凍存于本院-80 ℃冰箱中。

1.2 試劑與儀器

藏紅花素(批號:20170513)、順鉑(批號:20170427)均購于美國Sigma公司;胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購于美國Gibco BRL公司;青霉素、鏈霉素購于杭州碧云天公司;Annexin Ⅴ、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、四甲基偶氮畔藍(lán)(MTT)均購于BD Pharmingen公司;超敏ECL發(fā)光蛋白購自于美國Thermo Fisher公司;BCA檢測試劑盒、PVDF膜購于美國Millipore公司;Anti-p-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)、Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Bcl-2、Anti-cleaved-caspase3、Anti-β-Actin購自美國Cell Signaling公司;HRP標(biāo)記IgG購自于Santa Cruz公司;RNA提取試劑盒購于Invitrogene公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara公司;ERK抑制劑PD098059購于MedChemExpress公司;酶標(biāo)儀購于美國Thermo公司;流式細(xì)胞儀購于美國BD公司;凝膠圖像分析儀英國Alpha公司;垂直電泳儀美國Bio-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80 ℃中取出冰凍BGC-823細(xì)胞,37 ℃解凍后加入胰蛋白酶液消化,制備單細(xì)胞懸浮液,細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為1×106/ml接種于含10%FBS、雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí),添加2%胰酶消化,行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞處理及分組 實(shí)驗(yàn)一:取對數(shù)期生長細(xì)胞,分為空白組、藏紅花素組、順鉑組、藏紅花素+順鉑組?？瞻捉M細(xì)胞不進(jìn)行任何處理,藏紅花素組細(xì)胞中添加含8 mg/ml藏紅花素培養(yǎng)液處理,順鉑組細(xì)胞中添加0.8 μg/ml順鉑處理;藏紅花素+順鉑組細(xì)胞中同時(shí)添加0.8 μg/ml順鉑與8 mg/ml藏紅花素培養(yǎng)液,以上四組細(xì)胞處理后均培養(yǎng)48 h。

實(shí)驗(yàn)二:取對數(shù)期生長細(xì)胞,分為空白組、藏紅花素+順鉑組、ERK抑制劑組,藏紅花素+順鉑+抑制劑組(聯(lián)合組)?？瞻捉M細(xì)胞不進(jìn)行任何處理,藏紅花素+順鉑組細(xì)胞培養(yǎng)液中添加0.8 μg/ml順鉑與8 mg/ml藏紅花素,抑制劑組添加20 μmol/L PD098059;聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)液中依次添加20 μmol/L PD098059、0.8 μg/ml順鉑、8 mg/ml藏紅花素;四組細(xì)胞處理后均繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 收集1.3.2中實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞,消化后制備細(xì)胞懸液,濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml接種96孔板,設(shè)定6個(gè)平行孔,重復(fù)3次,各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24,36,48,72 h,在避光條件下加入10 μl MTT溶液,置于37 ℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,棄去每孔培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液,振蕩10 min,使紫色結(jié)晶物完全溶解。使用酶標(biāo)儀于570 nm波長下測定每孔吸光值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/空白組吸光度×100%。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)組,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 免疫印跡法(Western blot,WB)檢測BGC-823細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)及凋亡蛋白表達(dá)情況 收集1.3.2中實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞,添加細(xì)胞裂解液裂解BGC-823細(xì)胞,參照蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,統(tǒng)一上樣20 μg總蛋白,加熱煮沸、離心后行SDS-PAGE電泳,結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,于半干轉(zhuǎn)膜儀冰上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng),滴加Anti-ERK1/2(1 ∶1 000)、Anti-p-ERK1/2抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,添加二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h。加入ECL發(fā)光劑顯影后,置于凝膠成像儀中保存圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對圖片蛋白條帶進(jìn)行掃描,分析p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)水平,并檢測細(xì)胞中Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2(抗體均為1 ∶5 000)蛋白表達(dá)情況。

1.3.5 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 收集1.3.2中實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞,接種4×104個(gè)細(xì)胞至蓋玻片的6孔板內(nèi),將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上,待80%細(xì)胞融合后,舍棄培養(yǎng)液,將蓋玻片4%多聚甲醛過夜固定預(yù)冷PBS溶液清洗3次后,添加5 μg/ml的Hoechst 33258染液,室溫下避光孵育15 min,PBS清洗3次后,置于高內(nèi)涵活細(xì)胞成像儀中觀察BGC-823細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集1.3.2中實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞,添加PBS溶液清洗2次,加入0.2%胰酶溶液消化PBS溶液洗滌2次后,3 000 r/min離心5 min后,收集細(xì)胞,添加上樣緩沖液,細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/ml。先后添加5 μl Annexin-Ⅴ-FITC染液及PI染液,室溫下避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀中分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素聯(lián)合順鉑對細(xì)胞增殖抑制率的影響

與空白組相比,藏紅花素組、順鉑組、藏紅花素組+順鉑組24,36,48,72 h細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),與藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組于24,36,48,72 h細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05,見表1)。

2.2 藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞增殖抑制率的影響

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組24,36,48,72 h細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組增殖抑制率顯著升高(P<0.05,見表2)。

組別抑制率(%) 24 h36 h48 h72 h空白組0.08±0.020.05±0.01△0.06±0.020.07±0.02藏紅花素組6.85±0.53?7.38±0.19?△8.16±0.34?△★9.35±0.17?△★▲順鉑組7.24±0.75?7.42±0.25?8.59±0.16?△★9.67±0.21?△★▲藏紅花素+順鉑組13.39±1.58#15.66±2.15#17.42±2.23#△19.48±1.76#△★

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組比較,#P<0.05;與24 h比較,△P<0.05;與36 h比較,★P<0.05;與48 h比較,▲P<0.05

組別抑制率(%) 24 h36 h48 h72 h空白組0.07±0.010.04±0.010.05±0.010.06±0.02藏紅花素+順鉑組10.34±0.49?13.14±0.72?15.43±1.24?17.26±1.18?抑制劑組9.47±0.83?12.63±0.93?14.32±1.82?16.78±1.23?聯(lián)合組17.42±2.19#20.36±2.43#23.29±2.16#25.48±1.64#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較，#P<0.05;抑制劑組為ERK抑制劑(20 μmol/L PD098059),聯(lián)合組為藏紅花素+順鉑+抑制劑

2.3 各組ERK蛋白表達(dá)情況

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)均顯著降低(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)顯著降低(P<0.05)。各組ERK1/2蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05,見圖1,表3)。

1.空白組;2.藏紅花素+順鉑組;3.抑制劑組;4.聯(lián)合組圖1 藏紅花素+順鉑對ERK蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of crocin combined with cisplatin on expression of ERK protein in gastric cancer cells

組別ERK1/2p-ERK1/2 空白組0.85±0.091.09±0.13 藏紅花素+順鉑組0.84±0.080.67±0.08? 抑制劑組0.86±0.090.41±0.06? 聯(lián)合組0.85±0.060.25±0.04?#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

2.4 各組細(xì)胞形態(tài)變化情況

空白組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組細(xì)胞漿、細(xì)胞核濃縮,且細(xì)胞核破碎,聯(lián)合組破碎程度最明顯,較正常細(xì)胞熒光強(qiáng)度高,死亡細(xì)胞數(shù)量增多(見圖2)。

圖2 Hoechst33258染色觀察藏紅花素+順鉑組、抑制劑組和聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)變化 (×200)Figure 2 Morphological changes in crocin+cisplatin group, inhibitor group and combination group by Hoechst 33258 staining (×200)

2.5 藏紅花素聯(lián)合順鉑對胃癌細(xì)胞凋亡率的影響

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組相比,聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見圖3,表4)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測空白組、藏紅花素+順鉑組、抑制劑組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis in blank group, crocin+cisplatin group, inhibitor group and combination group by flow cytometry

組別凋亡率(%)空白組5.69±0.51藏紅花素+順鉑組41.41±2.68?抑制劑組43.47±3.06?聯(lián)合組73.12±5.17#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

2.6 各組凋亡蛋白表達(dá)情況

與空白組相比,藏紅花素+順鉑組、抑制劑組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),與藏紅花素組+順鉑組相比,聯(lián)合組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,見圖4,表5)。

1.空白組;2.藏紅花素+順鉑組;3.抑制劑組;4.聯(lián)合組圖4 Western blot檢測Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of Bax, cleaved-caspase 3, Bcl-2 protein expression by Western blot

組別BaxBcl-2cleaved-caspase3空白組0.32±0.040.88±0.050.17±0.04藏紅花素+順鉑組0.64±0.07?0.71±0.06?0.45±0.03?抑制劑組0.66±0.15?0.68±0.04?0.49±0.06?聯(lián)合組1.13±0.12#0.25±0.03#0.85±0.07#

與空白組比較,*P<0.05;與藏紅花素+順鉑組、抑制劑組比較,#P<0.05

3 討論

胃癌是臨床常見惡性腫瘤,臨床主要采用手術(shù)結(jié)合放化療治療,順鉑為常用化療藥物,但耐藥性較高,因此臨床療效有限,需結(jié)合其他藥物以提高治療效果[5]。以往臨床采用藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性,如免疫抑制劑、鈣通道阻斷劑、類固醇等,但由于以上藥物并非特異性藥物,用藥劑量較大,毒副作用較大,因此臨床應(yīng)用受限[6,7]。藏紅花素為藏紅花主要活性單體成分,具有較強(qiáng)抗腫瘤活性,對結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌等具有一定的抑制作用[8],然而藏紅花素聯(lián)合順鉑后是否可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的抑制作用,目前研究不多,因此探究兩者聯(lián)合應(yīng)用對胃癌的影響,對于胃癌的藥物治療十分重要。

大量研究[9]顯示藏紅花素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖,動物研究顯示前列腺癌小鼠給予藏紅花素治療后,體內(nèi)腫瘤生長速度明顯降低,生存期得到延長。胰腺癌中研究[10]發(fā)現(xiàn)藏紅花素對人HPAC細(xì)胞具有一定的抑制作用,且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示與空白組相比,藏紅花素處理組胃癌細(xì)胞BGC-823增殖抑制率明顯升高,流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示細(xì)胞凋亡率升高,提示藏紅花素處理可抑胃癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡。

藏紅花素聯(lián)合其他抗癌藥物治療后能夠改善臨床療效[11]。張珞等[12]研究顯示藏紅花素可提高肺腺癌細(xì)胞對順鉑、培美曲塞化療敏感性。此外還有研究顯示藏紅花素聯(lián)合順鉑后能夠提高對胃癌細(xì)胞的抑制作用,增強(qiáng)對胃癌細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[13]。本研究結(jié)果顯示與藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組細(xì)胞抑制率明顯升高,且凋亡率也明顯升高,推測與單獨(dú)采用藏紅花素組、順鉑組相比,藏紅花素+順鉑組可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的抑制、促凋亡作用。

目前對于藏紅花素抗腫瘤機(jī)制研究較多,如通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡以及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等發(fā)揮抗增殖、促凋亡作用[14],但目前其具體作用機(jī)制尚未得到證實(shí)。MAPK信號通路是將細(xì)胞外刺激傳遞至細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,主要參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,尤其在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要的作用。MAPK信號通路主要包括ERK、JNK/SAPK、P38、BMK1/ERK5四條通路,其中ERK目前研究最多,與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),較多研究顯示ERK信號通路參與胃癌細(xì)胞的凋亡、侵襲過程[15]。p-ERK為ERK的活化形式,ERK磷酸化活性增強(qiáng)后轉(zhuǎn)化為p-ERK,可促進(jìn)癌癥相關(guān)基因以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而參與細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖凋亡及分化和惡性轉(zhuǎn)化,持續(xù)激活ERK信號通路可促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤型轉(zhuǎn)化,而抑制ERK信號傳導(dǎo)通路則能促使腫瘤細(xì)胞慢慢恢復(fù)到非轉(zhuǎn)化型。金子等[16]研究顯示,姜黃素通過抑制ERK信號通路的活化,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡。漆黃素通過調(diào)控ERK信號通路誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡[17]。以上研究均提示ERK信號通路與癌細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)。

本研究顯示與藏紅花素+順鉑組、ERK抑制劑組相比,聯(lián)合組細(xì)胞抑制率、凋亡率進(jìn)一步降低,表明聯(lián)合處理后可進(jìn)一步降低細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡,這可能與阻斷MAPK/ERK信號通路活性有關(guān),結(jié)合過往研究推測藏紅花素+順鉑可能通過抑制ERK信號通路發(fā)揮腫瘤抑制、凋亡作用。

Bcl-2表達(dá)上調(diào)可抑制Bax的作用,從而促使Bax/Bax同源二聚體解離,形成穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異二聚體,達(dá)到抗凋亡的作用。當(dāng)Bax表達(dá)上調(diào)后,Bax/Bax同源二聚體將會增多,而線粒體通透性將會增加,進(jìn)而促使細(xì)胞色素C釋放,激活caspase家族,促進(jìn)凋亡[18]。本研究顯示與藏紅花素組+順鉑組、抑制劑組相比,聯(lián)合組Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,推測藏紅花素+順鉑組可上調(diào)Bax表達(dá)促進(jìn)Caspase3活化,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,藏紅花素聯(lián)合順鉑可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡;其作用機(jī)制可能與抑制ERK信號通路,上調(diào)凋亡蛋白表達(dá)有關(guān),然而胃癌細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制較復(fù)雜,是否還通過其他通路發(fā)揮作用,這還有待后續(xù)深入研究。