石榴皮多酚對人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠合理劑量及毒性作用研究

劉 盟， 王春梅， 宋建忠， 常占瑛， 高曉黎

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054； 3藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

石榴皮(GranatiPericarpium)為石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica)落葉灌木或小喬木石榴(PunicagranmumL.)的干燥果皮[1]，主要化學(xué)成分為安石榴苷(Punicalagin)、鞣花酸(Ellagic Acid)、石榴皮鞣素(Punicalin)和沒食子酸(Gallic Acid)等，具有殺蟲、澀腸、止血等功效，臨床上主要用于胃寒癥、腎寒癥、尿閉、肝水腫、腫瘤等疾病的治療[2-3]。本課題組前期研究表明石榴皮多酚具有抗腫瘤活性[4-5]，體外腫瘤細胞模型實驗證實石榴皮多酚對前列腺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等腫瘤細胞均有抑制增殖作用[6-8]。本研究采用上下法檢測石榴皮多酚對PC-3荷瘤小鼠的合理劑量，并采用蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and eosin, HE)法檢測石榴皮多酚對PC-3荷瘤小鼠心臟、肝臟和腎臟組織的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器BSA124S型電子天平(德國塞多利斯公司)，R201B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海弗魯克機電公司)，3131型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司)，CKX41型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，HC-3018R型離心機(合肥中科中佳公司)，UV-2550PC型紫外-可見分光光度儀器(日本島津公司)。

1.2 試藥DMEM培養(yǎng)基(購自賽默飛世爾公司公司，批號NXL0741)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號GVG0077)。

1.3 細胞人前列腺癌PC-3細胞株購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.4 實驗動物SPF級雄性BALB/c-nu裸鼠，3～4周齡，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘) 2009-0004。

1.5 藥材石榴皮藥材購于新疆喀什市藥材市場，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達·阿不力孜教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮。

1.6 方法

1.6.1 石榴皮多酚的提取純化方法 取石榴皮藥材，粉碎，過80目過篩，用60%乙醇浸漬提取3次，每次30 min，合并過濾減壓濃縮，冷凍干燥后得石榴皮多酚粗提物。經(jīng)HPD大孔吸附樹脂純化，用1.2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，上樣吸附12 h后，用蒸餾水-乙醇梯度洗脫，將洗脫液減壓濃縮后冷凍干燥即得石榴皮多酚純化物，備用。

1.6.2 人前列腺癌PC-3細胞培養(yǎng)方法 將人前列腺癌PC-3細胞接種于DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對生長期人前列腺癌PC-3細胞用于實驗。

1.6.3 石榴皮多酚對裸鼠LD50的測定方法 使用AOT425 StatPgm程序?qū)⒓墧?shù)因子(Sigma)設(shè)定為0.6，使用推薦的給藥劑量175、700、2 800 mg/kg進行給藥，裸鼠給藥后觀察14 d，記錄裸鼠中毒癥狀，將裸鼠存活和死亡的數(shù)據(jù)輸入AOT425 StatPgm程序中，計算石榴皮多酚對裸鼠的LD50值及95%置信區(qū)間。

1.6.4 前列腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建方法[9]取“1.6.2”項下人前列腺癌PC-3細胞用PBS清洗，經(jīng)0.25%胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基制成細胞濃度為1×107個/mL的人前列腺癌PC-3細胞懸液。各實驗組裸鼠腹部皮膚消毒后，用1 mL注射器取0.2 mL細胞懸液(2×106個細胞)接種于裸鼠腹部皮下，以腹部出現(xiàn)黃豆大小硬結(jié)節(jié)為模型構(gòu)建成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.5 動物分組及給藥方法 將建模成功的人前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠飼養(yǎng)于溫度25℃、濕度40%的環(huán)境中，自由飲食飲水。取腫瘤體積100～300 mm3的裸鼠32只隨機分組為：陰性對照組(生理鹽水，100 mL/kg體質(zhì)量)、石榴皮多酚低(80 mg/kg體質(zhì)量)、中劑量組(112 mg/kg體質(zhì)量)、高劑量組(187 mg/kg體質(zhì)量)，每組8只，各組裸鼠每天灌胃1次，連續(xù)灌胃17 d。

1.6.6 HE組織病理檢測方法 取人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠新鮮腫瘤組織塊，用10%福爾馬林溶液固定，脫水后將腫瘤組織石蠟包埋，切片后進行HE染色，顯微觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮多酚對裸鼠LD50的測定結(jié)果根據(jù)AOT425 StatPgm程序計算得石榴皮多酚對裸鼠的LD50為2 800 mg/kg，95%置信區(qū)間為981.8～ 3 250.0 mg/kg，見表1。

2.2 石榴皮多酚對人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠心臟、肝臟和腎臟組織的影響給藥期間各組人前列腺癌PC-3荷瘤小鼠飲食、精神狀況較好，荷瘤小鼠體質(zhì)量未見明顯下降。石榴皮多酚低劑量組荷瘤小鼠心臟、肝臟和腎臟組織未見病理性改變。石榴皮多酚中劑量組荷瘤小鼠心臟組織中少部分心肌細胞噬酸性病變，心肌間質(zhì)部分血管充血(圖1A和1B)，肝臟組織中少部分肝竇血管擴張，并伴有炎性細胞浸潤(圖1D和1E)。石榴皮多酚高劑量組荷瘤小鼠心臟組織中部分心肌間質(zhì)出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤(圖1A和1C)，肝臟組織中肝竇擴張充血，有炎性細胞浸潤(圖1D和1F)，腎臟組織中腎近曲小管輕度水腫(圖1G和1I)。

表1 石榴皮多酚對裸鼠的LD50

圖1 石榴皮多酚對荷瘤小鼠心臟、肝臟和腎臟組織的影響作用(HE×400)

3 討論

新藥在開展臨床試驗前必須進行動物模型急性毒性實驗，這是新藥安全性評價的重要環(huán)節(jié)，本研究在前期實驗基礎(chǔ)上進一步探究石榴皮多酚對人前列腺癌細胞PC-3荷瘤小鼠的急性毒性作用，采用上下法[10-11]計算石榴皮多酚對人前列腺癌細胞PC-3荷瘤小鼠的合理給藥劑量，實驗方法與張方舟等[12]采用上下法計算薄荷油的急性毒性LD50報道一致。研究結(jié)果表明石榴皮多酚中、高劑量組人前列腺癌細胞PC-3荷瘤小鼠的心臟、肝臟和腎臟組織有炎性細胞浸潤作用，但未見病理性損傷，這與石榴皮多酚抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用有關(guān)[13-15]，本研究為石榴皮多酚抗前列腺癌作用的研究提供了理論依據(jù)。