GnRH激動(dòng)劑在子宮腺肌病治療中自噬現(xiàn)象與作用機(jī)制研究

張迪

子宮腺肌病是生育期女性的常見疾病，主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)量增多及性交痛，同時(shí)，腺肌病也是導(dǎo)致女性不孕的常見原因之一。GnRH-a是治療子宮腺肌病的常用藥物，通過與GnRH-a受體結(jié)合，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，首先引起促性腺激素的釋放增加，此效應(yīng)為“flare-up effect”，大約持續(xù)10 d左右，后來由于促性腺激素的耗竭，促性腺激素釋放減少，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢分泌激素的減少，此效應(yīng)為“pituitary down-regulation”[1]。因腺肌病為雌激素依賴性疾病，雌激素的減少導(dǎo)致病灶萎縮，這被認(rèn)為是GnRH-a的作用機(jī)制。近年，有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GnRH-a可以抑制腺肌病在位內(nèi)膜的增殖，這提示在腺肌病治療中，GnRH-a除垂體降調(diào)節(jié)作用，可能還存在其他方面的作用機(jī)制。

自噬(autophagy)，由Ashford和Porter于1962年首次發(fā)現(xiàn)[2]，他們觀察到細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象，然后提出自噬的定義，即從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，進(jìn)而與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器的更新和細(xì)胞本身的代謝需求。自噬在炎癥、腫瘤、心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。目前，國內(nèi)外研究的三大類自噬相關(guān)疾病分別是腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和免疫性疾病[3-5]。本研究選擇與細(xì)胞周期密切相關(guān)的自噬為切入點(diǎn)，研究GnRH-a與小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬的相關(guān)性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR孕鼠5只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海，中國)，鼠齡7～8周，平均體重(40.0±0.5)g，均體健，在整個(gè)孕期，孕鼠均獨(dú)籠飼養(yǎng)，出生的雌性小鼠用于后續(xù)研究，小鼠均飼養(yǎng)于溫度可控的小鼠籠具中，房間光照/黑暗維持在12 h白天/12 h黑夜的周期。小鼠可以自由攝取食物和水。

二、方法

1.腺肌病小鼠模型的建立：根據(jù)不同干預(yù)措施將小鼠分為3組，分別是正常對(duì)照組(生理鹽水+生理鹽水)、腺肌病模型組(他莫昔芬+生理鹽水)、腺肌病GnRH-a治療組(他莫昔芬+GnRH-a)。子宮腺肌病模型鼠采用文獻(xiàn)報(bào)道的建模方法[6-7]，即新生小鼠飼養(yǎng)枸櫞酸他莫昔芬的方法。隨機(jī)選取16只雌性新生小鼠造模，鼠齡2～5 d，平均體重(2.0±0.1)g，均體健；另外8只作為正常對(duì)照組。建模小鼠于出生后第2～5 d(出生日為第1日)，滴喂5 ml/g的花生油/卵磷脂/煉乳混合液(體積比2：0.2：3)，并按體重加入2.7 μmol/kg的枸櫞酸他莫昔芬。正常對(duì)照組用生理鹽水代替枸櫞酸他莫昔芬，其他處置方法均與模型組小鼠相同。

飼養(yǎng)光照∶黑暗周期為12 h∶12 h, 室溫控制在(24.0±0.5)℃,小鼠可以自由獲取水，1～21 d齡由母鼠哺乳喂養(yǎng)，22 d起幼鼠與母鼠分籠飼養(yǎng)，幼鼠可自由攝食飲水。

于鼠齡75 d，按照隨機(jī)原則將16只子宮腺肌病模型鼠分為腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組，每組各8只。腺肌病GnRH-a治療組：給予單次長效GnRH-a 8 mg腹腔內(nèi)注射(輝凌制藥有限公司，基爾，德國)[8]；腺肌病模型組給予相同數(shù)量的生理鹽水，不含GnRH-a，其他處置方法與GnRH-a治療組相同。4周后，每日19:00～次日07:00與正常性成熟雄性小鼠以1∶1的比例合籠，次日8:00檢查雌鼠是否出現(xiàn)陰道栓，見陰栓日記為妊娠第1日，依次類推。雄性小鼠僅交配1次，且均有生育史。

2.標(biāo)本采集與保存：小鼠于妊娠第4日19:00～20:00處死，然后立即取子宮，所得子宮標(biāo)本，使用0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗，稱重后數(shù)碼相機(jī)拍照，然后將子宮分為3份，1份進(jìn)行HE染色，然后隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行子宮病理變化檢測，如果確認(rèn)造模成功，該標(biāo)本可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，將該子宮標(biāo)本的另一半采用“擠壓法”獲取子宮內(nèi)膜組織，于液氮內(nèi)速凍，然后置于-80 ℃冰箱凍存，供后續(xù)提取蛋白進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白檢測。剩余的第3份子宮標(biāo)本用于透射電鏡檢測。

3.組織形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)4%多聚甲醛固定的子宮標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，然后連續(xù)切片，厚度為4 μm，60 ℃烤片3 h，逐級(jí)脫蠟，脫水，行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜層是否完整、內(nèi)膜或腺體組織是否浸潤肌層內(nèi)，使用數(shù)碼相機(jī)拍照。HE染色步驟包括(1)二甲苯15 min，二甲苯15 min，無水乙醇5 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，75%乙醇5 min，50%乙醇5 min，蒸餾水5 min；(2)蘇木精染色5 min，洗掉多余染液；(3)1%鹽酸酒精分化3～5 s；(4)迅速置于自來水中，流水沖洗30 min；(5)0.5%～1%伊紅染液(45 s～1 min可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時(shí)間)；(6)95%乙醇Ⅰ(2 s～1 min)，95%乙醇Ⅱ(2 s或迅速)；(7)無水乙醇Ⅰ(1 min)，無水乙醇Ⅱ(1 min)；(8)二甲苯Ⅰ(5 min)，二甲苯Ⅱ(5 min)；(9)中性樹膠封片，自然風(fēng)干，置于顯微鏡下觀察。

4.自噬相關(guān)蛋白表達(dá)：相關(guān)蛋白包括自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，Beclin-1)。取子宮內(nèi)膜組織，置于冰盒上低溫操作，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃下組織勻漿，4 ℃靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，小心吸取上清液，-80 ℃凍存用時(shí)取出。用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，定量蛋白濃度，取等量的總蛋白約50 ug加入適量6×l aemelli buffer，用NETEN裂解液調(diào)整樣本體積保持上樣量的液體總體積相同。煮沸5 min蛋白變性，置于冰上迅速冷卻離心一下。上樣動(dòng)作要輕，防止上樣本溢出。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加一抗于4 ℃孵育過夜。加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，ECL澆膜，暗室中曝光，顯影，掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

5.自噬小體的觀察：(1)取子宮全層組織，大小1 mm×2 mm；(2)前固定。2%戊二醛PBS固定液固定2 h，4 ℃；(3)漂洗。PBS緩沖液洗滌2次，每次10 min，4 ℃；(4)后固定。1%鋨酸PBS固定液固定2 h，4 ℃；(5)漂洗。PBS緩沖液洗滌2次每次10 min，4 ℃；(6)脫水。30%→50%→70%乙醇逐級(jí)脫水，每次10 min，(70%乙醇含3%醋酸雙氧鈾)4 ℃，塊染，80%→95%→100%→100%乙醇逐級(jí)脫水，每次10 min；(7)置換。環(huán)氧丙烷，2次，每次10 min；(8)浸透。環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷1∶12 h，環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷2∶1，過夜，純環(huán)氧樹脂618包埋液浸透，37 ℃，6 h；(9)包埋。60 ℃烘箱內(nèi)48 h；(10)切片。LKB V型超薄切片機(jī)切片；(11)染色。枸櫞酸鉛電子染色；(12)觀察。PHILIP(荷蘭菲利浦公司)CM-120透射電鏡觀察。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間表達(dá)水平的比較采用非對(duì)稱t檢驗(yàn)，結(jié)果數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、子宮腺肌病模型的建立

在整個(gè)建模過程中，僅有1只小鼠模型未成功，GnRH-a治療組有兩只小鼠死亡，提示該方法是一種有效建模方法。腺肌病建模是否成功依靠病理學(xué)檢測，本實(shí)驗(yàn)采用HE染色法，結(jié)果如圖1，腺肌病模型組見子宮內(nèi)膜腺體異位于子宮肌層中，同時(shí)看到肌層細(xì)胞排列紊亂，伴增生、肥大(A、B)；腺肌病GnRH-a治療組，表現(xiàn)同腺肌病模型組，可見異位腺體萎縮(C、D)。

二、腺肌病GnRH-a治療作用與自噬相關(guān)性研究

1.子宮形態(tài)：通過正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組子宮稱重比較，正常對(duì)照組與腺肌病模型組的小鼠子宮重量相比，差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而腺肌病模型組經(jīng)GnRH-a治療后小鼠子宮的重量與治療前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、圖3。

2.自噬小體的數(shù)量：通過透射電鏡觀察顯示，正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見典型、數(shù)量較多的自噬小體，而在腺肌病模型組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見到典型的自噬小體，而經(jīng)GnRH-a治療后，在腺肌病模型組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)又見到典型的自噬小體，見圖4、圖5。

3.自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC-3)表達(dá)水平：3組自噬相關(guān)蛋白比較顯示，腺肌病模型組Beclin-1蛋白質(zhì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著減少，而腺肌病模型組接受GnRH-a治療后Beclin-1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加。LC-3Ⅱ蛋白質(zhì)表達(dá)水平結(jié)果同Beclin-1蛋白表達(dá)相似，即腺肌病模型組LC-3Ⅱ蛋白質(zhì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著減少，而腺肌病模型組接受GnRH-a治療后LC-3Ⅱ蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加。見圖6、圖7。

討 論

本研究中采用的ICR小鼠具有體格健壯，繁殖力強(qiáng)，生長速度快，適應(yīng)性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)。正常對(duì)照組小鼠病理組織學(xué)顯示平滑肌層纖維向心性規(guī)則地環(huán)繞在內(nèi)膜外，未見腺肌病病理改變的發(fā)生。而在腺肌病模型組，新生ICR小鼠給予滴喂他莫西芬，在100日齡左右時(shí)病理組織學(xué)檢查顯示內(nèi)膜腺體和間質(zhì)異位于肌層，同時(shí)伴有肌層平滑肌明顯的結(jié)構(gòu)紊亂，形成間質(zhì)浸潤。研究中僅有1例建模未成功，這和國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相似，即新生鼠喂養(yǎng)他莫昔芬可以誘導(dǎo)成年后子宮腺肌病的發(fā)生[7]。枸櫞酸他莫西芬具有抗雌激素的作用，其機(jī)制尚不明確，可能與其導(dǎo)致子宮肌層分化紊亂、組織結(jié)構(gòu)重塑有關(guān)[6]。2009年，李雁等[7]用陰道脫落細(xì)胞法監(jiān)測小鼠動(dòng)情周期的改變，結(jié)果顯示大部分105～110 d模型鼠動(dòng)情周期恢復(fù)正常，只有很少部分出現(xiàn)連續(xù)多日處于動(dòng)情期，從而排除枸櫞酸他莫昔芬本身對(duì)卵巢功能的影響。

Adenomyosis group (A、B); GnRH agonist treatment group (C、D). The arrow points to the area of the ectopic lesions圖1 腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組經(jīng) HE染色后光鏡結(jié)果(A、C：×40，B、D：×100)Figure 1 Light microscopy results of adenomyosis model group and GnRH agonist treatment group after HE staining(A、C：× 40，B、D：× 100)

圖2 正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組子宮大體標(biāo)本Figure 2 Uterus specimens of control group, adenomyosis model group and GnRH agonist treatment group

圖3 正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組子宮重量比較Figure 3 The uteruses weight of control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

圖4 正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組三組透射電鏡下所見(箭頭所指為典型的自噬小體，×4000)Figure 4Transmission electron microscope images of endometrial cells among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group (Arrows indicate representative autophagosomes, ×4000)

圖5 正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組三組自噬小體定量比較(*P<0.05)Figure 5 The number of autophagosomes among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group (*P<0.05)

圖6 自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組三組的表達(dá)情況Figure 6 The expression of autophagy-related proteins Beclin 1 among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

圖7 自噬相關(guān)蛋白LC-3在正常對(duì)照組、腺肌病模型組、腺肌病GnRH-a治療組三組的表達(dá)情況Figure 7 The expression of autophagy-related proteins LC-3 among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

自噬是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的重要途徑，可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬三大類，此分類方法是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)途徑的不同而分的，本實(shí)驗(yàn)主要研究第一大類，即大自噬，以下均簡稱自噬。自1950年左右，透射電鏡開始用于自噬的研究，目前被廣泛用于自噬形態(tài)學(xué)研究中[9]。在本研究實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病在位內(nèi)膜的自噬水平較正常對(duì)照組在位內(nèi)膜的自噬水平顯著降低，這主要表現(xiàn)為透射電鏡下自噬小體數(shù)量顯著減少。由于在透射電鏡下有時(shí)很難區(qū)別自噬小體和細(xì)胞內(nèi)囊泡狀結(jié)構(gòu)，為了克服該不足，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了自噬相關(guān)蛋白，即Becilin-1和LC-3的表達(dá)水平。在腺肌病模型組，兩種蛋白的表達(dá)水平也顯著低于正常對(duì)照組，和本實(shí)驗(yàn)透射電鏡的觀察結(jié)果相同。眾所周知，子宮腺肌病雖然被認(rèn)為是子宮良性疾病，但它卻具有類似于惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如內(nèi)膜細(xì)胞增殖破壞細(xì)胞外的基質(zhì)，破壞、突破基底板，進(jìn)而遷徙進(jìn)入子宮肌層種植生長并不斷進(jìn)一步遷移，這種類似于惡性腫瘤的生物學(xué)行為也是子宮腺肌病主要的發(fā)病機(jī)制之一。2003年，Qu等[10]通過一項(xiàng)腫瘤小鼠模型體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1等位基因的缺失可以導(dǎo)致自噬水平顯著降低，進(jìn)而細(xì)胞增殖速度加快。此外，2007年，Takahashi等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Bif-1與自噬相關(guān)基因Beclin-1結(jié)合，進(jìn)而激活自噬或者是激活腫瘤抑制因子，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果顯示，子宮腺肌病在位內(nèi)膜Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組的表達(dá)水平，提示腺肌病自噬水平異常降低，進(jìn)而使細(xì)胞增殖速度加快，Beclin-1蛋白表達(dá)的減低可能利于子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)增殖并侵襲進(jìn)入子宮肌層進(jìn)而在子宮肌層中遷移、生長，可見Beclin-1在子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。另外有研究顯示[12]，子宮腺肌病在位內(nèi)膜與正常生育期女性的在位內(nèi)膜相比，存在免疫機(jī)制的異常，包括細(xì)胞表面抗原、粘附分子、巨噬細(xì)胞及免疫細(xì)胞及免疫復(fù)合物的數(shù)量及成分，同時(shí)在腺肌病患者外周血中也發(fā)現(xiàn)存在異常的自身抗體。Paludan等[13]曾報(bào)道，自噬有助于MHC2復(fù)合物對(duì)體內(nèi)長期存在抗原的監(jiān)視作用，從而在抗原提呈過程中發(fā)揮重要作用，提示子宮腺肌病患者的自噬水平被抑制后，可能有利于異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，進(jìn)而有利于在子宮肌層種植播散，最終導(dǎo)致了子宮腺肌病的發(fā)生。2008年，Wang等[14]通過研究34例子宮腺肌病患者及11例子宮肌瘤患者在位及異位內(nèi)膜組織發(fā)現(xiàn)，腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜白細(xì)胞抗原-G表達(dá)水平均異常增高，從而逃避免疫監(jiān)視及免疫清除，可見自噬和免疫調(diào)節(jié)之間也存在密切的關(guān)系。

在本項(xiàng)研究，即子宮腺肌病中GnRH-a與自噬相關(guān)性研究中，子宮腺肌病模型組小鼠經(jīng)GnRH-a治療后，在位子宮內(nèi)膜自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3的表達(dá)水平均顯著升高，此外，在透射電鏡下本研究觀察到自噬小體的數(shù)量較未治療組也明顯增加。Choi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜細(xì)胞，甾體激素藥物(達(dá)那唑)可以抑制Akt和ERK1/2的活性，進(jìn)而抑制mTOR，最終誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，由于GnRH-a同達(dá)那唑類似，均具有抗促性腺激素作用，提示GnRH-a可能通過類似的機(jī)制，即Akt-ERK1/2-mTOR途徑發(fā)揮作用，這需要后續(xù)的深入研究。

此外，本研究也提示GnRH-a的作用原理除了產(chǎn)生“低雌激素”的作用機(jī)制外，尚有部分是以自分泌或旁分泌機(jī)制通過與其局部受體結(jié)合，介導(dǎo)直接抑制子宮在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其自噬，提高其自噬水平，減少其向遠(yuǎn)處發(fā)展的可能，從而達(dá)到治療效果。

本研究顯示子宮腺肌病小鼠在位內(nèi)膜自噬水平低于正常對(duì)照組，說明自噬水平的減低，在子宮腺肌病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮一定作用，它可能發(fā)展成為治療子宮腺肌病新的靶點(diǎn)；而經(jīng)GnRH-a治療后，在位子宮內(nèi)膜的自噬水平顯著提高，提示GnRH-a可通過糾正異常的自噬水平發(fā)揮治療作用，對(duì)GnRH-a的作用機(jī)制有了更加深入的認(rèn)識(shí)。在臨床工作中可考慮將自噬、凋亡誘導(dǎo)/抑制藥物與降調(diào)方案配合使用，以期增強(qiáng)GnRH-a降調(diào)方案對(duì)腺肌病不孕癥患者的治療效果。

(圖4見封三)