BALB/c突變卷毛小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合對(duì)比分析

李曉娟，李興杰，侯 俊，孫慧偉，馮 帆，王志杰，李 潤(rùn)，李瑞生*

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心，北京 100039； 2.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853； 3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床檢驗(yàn)診療中心，北京 100039)

皮膚是哺乳動(dòng)物最大的器官，具有屏障、吸收、代謝免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，其完整性及穩(wěn)態(tài)直接關(guān)系到機(jī)體的健康狀態(tài)[1]。皮膚創(chuàng)傷愈合一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，由于皮膚的創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生成、基質(zhì)沉積和皮膚重塑等方面[2-3]。而我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)突變卷毛對(duì)小鼠的皮膚外觀和毛囊結(jié)構(gòu)有一定的影響，與正常小鼠存在著一定差異[4]，因而推測(cè)突變卷毛基因可能對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合也可能有所影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB/c突變卷毛小鼠與對(duì)照BALB/c小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合能力進(jìn)行了比較分析，以了解突變小鼠的皮膚與對(duì)照小鼠皮膚應(yīng)對(duì)創(chuàng)傷的修復(fù)能力是否存在差異，探討這種差異對(duì)皮膚修復(fù)起到促進(jìn)或抑制的作用，為今后研究卷毛小鼠突變基因的作用以及為本突變小鼠成為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)研究模型的可能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)6周齡BALB/c突變卷毛小鼠10只，雌性，18～20 g，來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室近交培育(全同胞兄妹交配)；選擇SPF級(jí)6周齡BALB/c小鼠10只，雌性，18～20 g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0002]。飼養(yǎng)室[SYXK(軍)2017-0016]溫度22℃～ 25℃，環(huán)境濕度40%，自由進(jìn)食和飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，項(xiàng)目倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-2017-006。

1.2 主要試劑與儀器

甲醛(批號(hào)：1210122，西隴化工股份有限公司)；生理鹽水(批號(hào)：130520405，石家莊四藥有限公司)；異氟烷(批號(hào)：217172201，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；天狼猩紅染料自行配置；石蠟切片機(jī)(美國(guó)AO)，正置顯微鏡(日本NIKON)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠皮膚創(chuàng)面模型制備

本實(shí)驗(yàn)分為2組：突變小鼠組(10只)和對(duì)照(正常)小鼠組(10只)。將兩組小鼠分別經(jīng)異氟烷麻醉，剃去背部毛，碘伏局部消毒，以脊柱為中線，用無(wú)菌眼科剪在小鼠背部切除全層皮膚，形成兩個(gè)直徑約0.5 cm皮膚全層損傷創(chuàng)面，深及筋膜，無(wú)菌紗布止血。造模成功后拍照記錄，放回鼠籠單籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3.2 小鼠創(chuàng)口愈合的觀察指標(biāo)

皮膚創(chuàng)傷模型建立后，觀察創(chuàng)口外觀的變化情況，創(chuàng)緣上皮化和局部肉芽組織的顏色及形態(tài)。同時(shí)根據(jù)張凱等方法[5]，分別在創(chuàng)傷后第3、7、10、14天透明硫酸紙覆蓋于創(chuàng)口表面，沿創(chuàng)口外緣畫線，用正交坐標(biāo)紙測(cè)量創(chuàng)口面積，計(jì)算愈合率，愈合率=(1-切口面積/原切口面積)×100%。

1.3.3 小鼠皮膚組織病理學(xué)檢測(cè)

在術(shù)后第3、7、10、14天測(cè)量完愈合創(chuàng)口面積后，從兩組中隨機(jī)分別取2只小鼠，麻醉后取創(chuàng)面新生皮膚組織及周圍少許正常皮膚，用4%多聚甲醛固定，將固定好的組織脫水、包埋、切片，進(jìn)行HE染色和天狼猩紅染色，顯微鏡下觀察不同階段新生皮膚病理學(xué)改變，拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠創(chuàng)面愈合皮膚外觀對(duì)比分析

肉眼觀察顯示，兩組小鼠的兩個(gè)創(chuàng)面恢復(fù)都存在先后現(xiàn)象。而卷毛小鼠創(chuàng)后3 d可觀察到由少量的稠液滲出量，創(chuàng)面呈向心性生長(zhǎng)，有明顯的結(jié)痂覆蓋(見(jiàn)圖1B)，創(chuàng)后7 d皮膚創(chuàng)緣出現(xiàn)了上皮化現(xiàn)象(見(jiàn)圖1C)，創(chuàng)后10 d創(chuàng)面持續(xù)減少，可見(jiàn)清晰的較小的愈合面(見(jiàn)圖1D)，創(chuàng)后14 d可見(jiàn)創(chuàng)面已愈合，完全上皮化，愈合面幾乎肉眼看不清(見(jiàn)圖1E)；而對(duì)照組小鼠在創(chuàng)后3 d稠液滲出量較多，創(chuàng)面僅出現(xiàn)較小的縮小，有炎癥反應(yīng)發(fā)生(見(jiàn)圖1G)，創(chuàng)后7 d皮膚創(chuàng)面滲出液減少，傷口周圍干燥出現(xiàn)結(jié)痂(見(jiàn)圖1H)，創(chuàng)后10 d創(chuàng)面出現(xiàn)大面積的愈合(見(jiàn)圖1I)，創(chuàng)后14 d創(chuàng)面愈合，出現(xiàn)上皮化，愈合后的疤痕清晰可見(jiàn)(見(jiàn)圖1J)。對(duì)照小鼠愈合速度慢于卷毛小鼠。

2.2 兩組小鼠創(chuàng)傷愈合率及創(chuàng)面愈合時(shí)間對(duì)比分析

根據(jù)前述公式計(jì)算皮膚愈合率結(jié)果顯示：卷毛小鼠的皮膚在創(chuàng)后3 d、7d的愈合率顯著高于對(duì)照小鼠的愈合率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在創(chuàng)后10 d和14 d兩組小鼠的愈合率不具有顯著差異。(見(jiàn)表1)

2.3 兩組小鼠創(chuàng)傷愈合過(guò)程中皮膚形態(tài)學(xué)改變對(duì)比分析

HE染色結(jié)果顯示：皮膚創(chuàng)后3 d：卷毛小鼠的創(chuàng)面膠原纖維明顯增多，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，而對(duì)照小鼠創(chuàng)后3 d的創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)多于卷毛小鼠，膠原纖維增多的程度少于卷毛小鼠(見(jiàn)圖2A和2E)；創(chuàng)后7 d：卷毛小鼠的膠原增長(zhǎng)迅速，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)繼續(xù)增多，肉芽組織顯著增多，可見(jiàn)部分表皮再生生長(zhǎng)，對(duì)照小鼠的損傷部位仍只能看到膠原增厚，修復(fù)痕跡還不明顯(見(jiàn)圖2B和2F)；創(chuàng)后10 d：卷毛小鼠的膠原修復(fù)基本完成，肉芽組織幾乎將破損處填平，創(chuàng)面上皮基本上皮化，而且能看到新生的毛囊，而對(duì)照小鼠的破損修復(fù)也基本完成，但是還沒(méi)有毛囊的新生(見(jiàn)圖2C和2G)。創(chuàng)后14 d：卷毛小鼠新生皮膚中毛囊已經(jīng)有毛發(fā)生長(zhǎng)，對(duì)照小鼠的皮膚中還未看到毛發(fā)生長(zhǎng)(見(jiàn)圖2D和2H)。

注：A～E：依次為卷毛小鼠0, 3, 7, 10 d和14 d；F～J：依次為對(duì)照小鼠0, 3, 7, 10 d和14 d。圖1 兩組小鼠外觀特征的對(duì)比Note. A-E, Curly mice at 0, 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. F-J, Control mice at 0, 3, 7, 10 d and 14 d, respectively.Figure 1 Comparison between the appearance of the mice in the two groups

Table1Comparison of wound healing rates at different time points in the two groups

組別Groups愈合率(%)Heating rate(%)3 d7 d10 d14 d卷毛小鼠Curly mice65.23±2.45?82.14±3.10?90.25±2.9898.32±1.10對(duì)照小鼠Control mice36.02±1.6762.37±1.2482.74±1.5493.78±0.98

注：與對(duì)照小鼠比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control mice,*P<0.05.

天狼猩紅染色結(jié)果顯示：根據(jù)文獻(xiàn)[6]，I型膠原染成粉紅色，可觀察到膠原和肉芽組織染為淡粉紅色。表皮、毛囊和毛發(fā)染為黃色。卷毛小鼠在創(chuàng)后3 ～ 14 d可以清晰的看到膠原纖維和肉芽組織從底層逐漸頂替修復(fù)破損部位，直至表皮和毛囊生長(zhǎng)出來(lái)。而對(duì)照小鼠的修復(fù)過(guò)程與卷毛小鼠相似，但恢復(fù)時(shí)間較慢(見(jiàn)圖3)。

3 討論

皮膚作為與外界接觸的屏障，在創(chuàng)傷愈合中起非常重要的作用[7]。皮膚創(chuàng)傷愈合不僅是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，更是一個(gè)高度復(fù)雜的生物過(guò)程，由炎癥、增殖和重塑三個(gè)重疊的階段組成[8]。任何一個(gè)或多個(gè)階段的損傷以及年齡等因素都會(huì)導(dǎo)致皮膚的修復(fù)過(guò)程的障礙和改變[9-10]，因此皮膚創(chuàng)傷愈合一直是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。王海濤[11]等探討了皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中皮膚干細(xì)胞的分布以及增殖分化遷移特征。伍小敏[12]等研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因?qū)梢源龠M(jìn)小鼠全層皮膚損傷愈合以及能夠促進(jìn)GM-CSF表達(dá)在皮膚愈合中發(fā)揮的作用。Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)富含血小板的纖維蛋白可以通過(guò)增加血管的形成來(lái)加速糖尿病小鼠模型的皮膚傷口愈合。國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合均進(jìn)行了探討和研究，但對(duì)皮膚愈合機(jī)制尚未有定論，同時(shí)對(duì)于基因突變小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合尚未見(jiàn)報(bào)道。

注：A～D：依次為卷毛小鼠3, 7, 10 d和14 d；E～H：依次為對(duì)照小鼠3, 7, 10 d和14 d。藍(lán)色箭頭可見(jiàn)炎癥細(xì)胞。圖2 兩組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Note. A-D, Curly mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. E-H, Control mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. The blue arrow shows inflammatory cells.Figure 2 The skin histopathology of mice in the two groups. HE staing

注：A～D：依次為卷毛小鼠3, 7, 10 d和14 d；E～H：依次為對(duì)照小鼠3, 7, 10 d和14 d。藍(lán)色箭頭可見(jiàn)膠原修復(fù)處。圖3 兩組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察(天狼猩紅染色，× 200)Note. A-D, Curly mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. E-H, Control mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. The blue arrow is visible at the collagen repair.Figure 3 The skin histopathology of mice in the two groups. Sirius red staining

本實(shí)驗(yàn)對(duì)BALB/c突變卷毛小鼠與對(duì)照BALB/c小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合能力進(jìn)行了比較分析：從創(chuàng)口愈合的外觀結(jié)果顯示卷毛小鼠在創(chuàng)傷后的3～7 d為愈合急速期，愈合能力顯著強(qiáng)于對(duì)照小鼠，而在愈合后期10～14 d，兩組的愈合速度及愈合率相差不多。同時(shí)我們從兩組小鼠測(cè)量創(chuàng)口計(jì)算的愈合率結(jié)果也能看出：卷毛小鼠的皮膚在創(chuàng)后3 d和7 d的愈合率顯著高于對(duì)照小鼠的愈合率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在創(chuàng)后10 d和14 d兩組小鼠的愈合率不具有顯著性差異。病理分析結(jié)果顯示：皮膚創(chuàng)后3 d時(shí)卷毛小鼠的創(chuàng)面膠原纖維明顯增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，對(duì)照小鼠的創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)多于卷毛小鼠，膠原纖維增多的程度少于卷毛小鼠，與外觀結(jié)果相符合。創(chuàng)傷愈合的起始階段為炎癥反應(yīng)，主要包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)以及炎性因子的分泌[14]。隨后進(jìn)入增殖階段，首先是肉芽組織的增生，肉芽組織在組織損傷后 2～3 d內(nèi)即可出現(xiàn)[15]。病理結(jié)果也顯示卷毛小鼠3 d和7 d的肉芽組織生長(zhǎng)極其旺盛，因此對(duì)皮膚愈合起到關(guān)鍵的推動(dòng)作用。天狼猩紅染色結(jié)果能夠更好的顯示膠原修復(fù)的過(guò)程，其結(jié)果與HE染色結(jié)果相同，進(jìn)一步印證了卷毛小鼠在創(chuàng)傷修復(fù)前期的修復(fù)能力強(qiáng)于對(duì)照小鼠。卷毛小鼠前期皮膚修復(fù)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，BALB/c突變卷毛小鼠在皮膚創(chuàng)傷前期的愈合修復(fù)能力顯著強(qiáng)于對(duì)照BALB/c小鼠，因此我們可以推斷該突變基因不僅對(duì)該突變小鼠的皮膚組織和毛囊的發(fā)育周期產(chǎn)生了影響[16]，而且對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合能力也產(chǎn)生了促進(jìn)作用，此結(jié)果為我們進(jìn)一步研究突變基因?qū)ζつw的影響提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為BALB/c突變卷毛小鼠模型應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)模型以及研究皮膚創(chuàng)傷愈合機(jī)制奠定了理論平臺(tái)。