胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、鑒定方法及預(yù)后的評估價值*

丁善航 綜述 修典榮 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科，北京 100191)

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)預(yù)后很差，大多數(shù)患者診斷時已失去手術(shù)機(jī)會[1]，選擇合適的腫瘤標(biāo)志物對胰腺癌患者進(jìn)行預(yù)后評估有助于選擇及調(diào)整治療方案以使患者生存獲益，但目前胰腺癌尚缺少相關(guān)的高特異性和靈敏性的生物標(biāo)記物。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，通過相關(guān)檢測手段可在血液循環(huán)中檢測到[2]。CTCs表達(dá)水平的高低與腫瘤惡性程度、輔助治療療效及預(yù)后相關(guān)，具有作為腫瘤特異性標(biāo)記物的潛在價值[3～5]，但在循環(huán)中含量很少，難以被富集，成為限制研究的瓶頸。近年來，隨著CTCs檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，CTCs 作為腫瘤生物標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)后評估的研究逐漸成為熱點(diǎn)[6]。本文就CTCs主要的富集、鑒定方法及其在胰腺癌預(yù)后評估價值的相關(guān)研究做文獻(xiàn)總結(jié)。

1 CTCs的富集和鑒定

1.1 CTCs的富集

CTCs在循環(huán)中分布和取樣的部位有外周血和門靜脈，外周血常用的取樣部位有肘靜脈、足背靜脈等，由于取材方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，目前大部分CTCs研究采取該方式，但外周循環(huán)中CTCs數(shù)量極少，通常為0～102/ml[7，8]，對分離富集技術(shù)要求較高。對CTCs進(jìn)一步的富集需要利用CTCs與血細(xì)胞在特定參數(shù)上的差異而篩選出CTCs，主要分為基于物理學(xué)特征和免疫學(xué)特征的富集方法兩大類。由于富集純度高以及保持細(xì)胞活性等方面優(yōu)勢，免疫學(xué)富集方法相較于傳統(tǒng)物理學(xué)富集方法應(yīng)用更為廣泛，但物理學(xué)富集方法仍具有特有優(yōu)勢。

1.1.1 基于物理學(xué)特征的富集方法

密度梯度離心法利用分離介質(zhì)及高速離心使存在密度差異的細(xì)胞群落分層從而分離富集CTCs，該方法富集CTCs的過程不受細(xì)胞表面標(biāo)志物下調(diào)的影響，可獲得較高的檢出率。Buscail 等[9]對比密度梯度離心法和免疫學(xué)原理的RosetteSep系統(tǒng)的檢測效率，結(jié)果顯示密度梯度離心法更可靠，CTCs采收率為(56±23)%，明顯高于RosetteSep系統(tǒng)采收率(39±27)%(P<0.001)。但該方法相對其他方法富集CTCs的純度較低，活性較弱，限制了其使用。

膜濾過富集法利用CTCs直徑大于其他血細(xì)胞的特點(diǎn)，通過濾膜過濾將CTCs與其他細(xì)胞分離而進(jìn)行富集，常用的MetaCell、ISET系統(tǒng)即利用血樣通過孔徑為8 μm的高分子材料聚碳酸脂膜來過濾、分離、富集CTCs。該類方法能夠較好地保持細(xì)胞原有形態(tài)，同時較少受CTCs表型改變的影響[10]，具有較高的富集性能[11]，但易混雜其他血細(xì)胞導(dǎo)致富集純度偏低。

1.1.2 基于免疫學(xué)特征的富集方法

免疫學(xué)富集方法是利用CTCs和血細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板)及其他細(xì)胞抗原標(biāo)志物的差異進(jìn)行分選的一類方法。免疫磁珠分離法是目前最常用的CTCs富集方法之一，該方法利用特異性的單克隆抗體標(biāo)記的磁珠結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原來識別CTCs，其中以上皮源性惡性腫瘤均表達(dá)的上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)最常用，通過外加磁場作用吸附抗原-抗體復(fù)合物從而分離富集CTCs。由于原發(fā)性腫瘤細(xì)胞可發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等變化導(dǎo)致CTCs內(nèi)部存在異質(zhì)性，部分CTCs轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型不再表達(dá)EpCAM等上皮型標(biāo)志物[12]，導(dǎo)致依賴上皮型標(biāo)記物的免疫學(xué)富集方法CTCs采收率偏低[13，14]。

微流控芯片是一類檢測過程可實(shí)現(xiàn)自動化的高分子微流控裝置，采樣、稀釋、添加試劑、反應(yīng)、分離等流程被集成到一塊芯片上，可控流體在芯片中流動時CTCs 的生物標(biāo)志物被芯片識別從而捕獲樣本中的CTCs。目前，最常用的生物標(biāo)志物為EpCAM，主要有CTC-chip、CTC-HBchip、CTC-ichip和CMx等平臺，這些微流控芯片優(yōu)點(diǎn)在于富集流程高度自動化，且能使富集的CTCs保持較高的活性[15]，但仍然無法完全避免EpCAM下調(diào)導(dǎo)致的采收率偏低。Chikaishi等[16]報道一種非EpCAM依賴性檢測的光固化樹脂微流控平臺，該芯片平臺增加平足蛋白抗體這一非上皮型腫瘤標(biāo)記物抗體，在同一樣本條件下采收率相對于傳統(tǒng)的EpCAM依賴性平臺采收率增加78.3%。

1.2 CTCs的鑒定

1.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC)

ICC是利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)使熒光素、同位素、酶等顯色劑顯色來確定腫瘤細(xì)胞特異性抗原從而鑒定CTCs的方法，是目前使用最廣泛的CTCs測定方法。CellSearch系統(tǒng)的細(xì)胞鑒定部分即為該原理[17]。CellSearch系統(tǒng)是唯一通過美國FDA批準(zhǔn)多用于臨床乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌的CTCs檢測系統(tǒng)，在胰腺癌CTCs中應(yīng)用也取得一定進(jìn)展。CTCs經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定主要表現(xiàn)為上皮型標(biāo)志物抗體如EpCAM、上皮型鈣黏蛋白(E-Cadherin)、細(xì)胞角蛋白8/18/19(cytokeratin 8/18/19，CK8/18/19)抗體等[18～22]標(biāo)記為陽性，血細(xì)胞特異性標(biāo)志物如CD45等抗體標(biāo)記陰性。由于EMT的存在導(dǎo)致部分CTCs轉(zhuǎn)變?yōu)榉巧掀け硇?，使依賴上皮型?biāo)志物的ICC技術(shù)鑒定存在誤差[23]。近年來，一些非上皮型標(biāo)志物如波形蛋白(Vimentin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-Cadherin)、鋅指結(jié)構(gòu)E-box結(jié)合蛋白1(Zinc finger E-box binding homebox 1，ZEB1)等的應(yīng)用提高了CTCs的檢出率[12，24，25]。但目前TCC尚無統(tǒng)一的 CTCs 標(biāo)記物鑒定方案及標(biāo)準(zhǔn)，使用不同標(biāo)記物方案的ICC方法的研究鑒定結(jié)果存在較大差異。

上皮細(xì)胞免疫斑點(diǎn)法(epithelial immunospot，EPISPOT)使用涂有特定標(biāo)記物抗體斑點(diǎn)的硝化纖維素膜與待測樣本中腫瘤細(xì)胞分泌蛋白結(jié)合產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)，再采用攝像機(jī)成像和計算機(jī)輔助分析技術(shù)對免疫反應(yīng)斑點(diǎn)進(jìn)行分析以鑒定CTCs的技術(shù)，該技術(shù)是目前唯一能在單細(xì)胞水平上測定有活性細(xì)胞的CTCs的鑒定方法，已用于結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤類型[26]。Budna等[14]利用 EPISPOT、CellCollector、CellSearch 3種檢測方法測定前列腺癌CTCs，結(jié)果顯示相同樣本EPISPOT的檢出率(54%)高于CellCollector(52%)和CellSearch(13%)，EPISPOT 技術(shù)相對于EpCAM依賴性測定方法有更高的臨床應(yīng)用價值。但因死細(xì)胞、無活性細(xì)胞不能分泌足夠的蛋白質(zhì)以進(jìn)行檢測，該法僅能測定有分泌功能的活性CTCs，且目前缺少胰腺癌CTCs特異性分泌蛋白標(biāo)志物，該技術(shù)胰腺癌相關(guān)的應(yīng)用及研究較少。

1.2.2 熒光原位雜交術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) FISH通過將熒光核酸探針以堿基互補(bǔ)配對的方式，與待測樣本中的特定細(xì)胞核酸序列配對雜交測定CTCs，具有實(shí)驗(yàn)周期短、特異性好、定位準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[27]，常應(yīng)用于CTCs相關(guān)染色體易位片段的研究。FISH與免疫學(xué)測定方法聯(lián)合使用可以提高CTCs檢出率，是目前應(yīng)用于CTCs檢測的主要形式。Xu等[28]用8號染色體陰性富集聯(lián)合FISH NE-iFISH系統(tǒng)檢測40例PDAC外周血CTCs,陽性率為90% (36/40)，ROC曲線顯示當(dāng)截斷值為1.5 CTCs7.5 ml時，對CTCs的檢測靈敏度為77.5%，特異性為79.1%，同一標(biāo)本條件下鏡檢NE-iFISH系統(tǒng)測得CTCs亞型多樣性明顯強(qiáng)于CellSearch系統(tǒng)。Ko等[29]報道1種免疫磁珠與RNA熒光原位雜交技術(shù)(Turbo RNA FISH)相結(jié)合的新型CTCs檢測平臺，由于具備FISH的高特異性和磁微孔對CTCs的高敏感性，有早期診斷胰腺癌的潛力，但聯(lián)合檢測方案操作步驟相對復(fù)雜，容易造成信號丟失出現(xiàn)假陰性，對設(shè)備和試劑水平要求較高，一定程度上限制其推廣應(yīng)用。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) RT-PCR通過PCR技術(shù)擴(kuò)增并識別腫瘤特異性mRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄DNA片段從而對CTCs進(jìn)行測定。目前，胰腺癌CTCs常用的mRNA序列有CK20 mRNA、CEA mRNA、EpCAM mRNA等[30]。由于技術(shù)手段成熟且特異性高，RT-PCR已成為目前最主流的CTCs測定方法之一，廣泛應(yīng)用于多種類型腫瘤CTCs 的檢測及其預(yù)后研究[31]。RT-PCR同時也是胰腺癌 CTCs 分子生物學(xué)標(biāo)志物研究及生物治療靶點(diǎn)研究的重要方法。Xu等[32]采用RT-PCR檢測并發(fā)現(xiàn)胰腺癌CTCs中受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)mRNA表達(dá)水平升高，ROR1有成為胰腺癌治療靶點(diǎn)的潛在價值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM) FCM是一項(xiàng)以細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為基礎(chǔ)，能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量高速分析和分選的測定手段，能同時從一個細(xì)胞中測得細(xì)胞內(nèi)DNA含量、細(xì)胞活力及細(xì)胞特異性標(biāo)志物等多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等顯著優(yōu)點(diǎn)。Guglielmi等[33]采用ClearCell FX1系統(tǒng)(基于腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物 EpCAM、CD45等)標(biāo)記胰腺癌患者 CTCs并使用流式細(xì)胞儀分離CTCs，獲得較高的檢出率(60%)的同時保持CTCs的完整性。主要缺點(diǎn)在于靈敏度還不夠高，存在細(xì)菌污染、細(xì)胞凝集等問題[34]。近年來，以FCM為基礎(chǔ)的許多新型技術(shù)如活體無標(biāo)記光聲流式圖像細(xì)胞儀(photoacoustic flow cytometry, PAFC)、單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)譜分析細(xì)胞儀、聲波聚焦細(xì)胞儀等提高CTCs測定效率和靈敏度，具有無創(chuàng)檢測、異質(zhì)性亞群分析等優(yōu)勢[34～37]。

2 CTCs檢測在胰腺癌預(yù)后評估中的應(yīng)用

2.1 CTCs與胰腺癌預(yù)后

胰腺癌常用的標(biāo)志物CA19-9、CA242等靈敏度、特異度較差，仍缺少高特異性的預(yù)后評估標(biāo)志物[38]。CTCs是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移前亞群具有作為潛在預(yù)后評估標(biāo)記物的價值[14]。Yang等[39]采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測胰腺癌患者外周血CTCs，外周血<3 CTCs7.5 ml組總體生存期顯著長于≥3 CTCs7.5 ml組(15.2月 vs. 10.2月,P=0.023)，多因素分析顯示單位外周血高 CTCs計數(shù)是胰腺癌預(yù)后較差的獨(dú)立危險因素(HR=4.547，95%CI: 1.323～15.625，P=0.016)。

由于EMT等分子生物學(xué)改變的發(fā)生，CTCs群體內(nèi)部存在異質(zhì)性，不同表型CTCs的預(yù)后評估價值也存在一定差異。Katherine等[40]通過免疫熒光法用細(xì)胞角蛋白、波形蛋白抗體鑒定50例胰腺癌外周血CTCs，結(jié)果顯示39例(78%)CTCs為單純上皮表型，表達(dá)細(xì)胞角蛋白而不表達(dá)波形蛋白，26例(67%)CTCs表達(dá)細(xì)胞角蛋白的同時也表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白，外周血中只表達(dá)上皮表型標(biāo)志物的CTCs檢出是胰腺癌患者總生存期短的獨(dú)立危險因素(P<0.01)，表達(dá)上皮和間質(zhì)表型的CTCs檢出是腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測因子(HR=2.78, 95%CI：1.31～5.88,P=0.01)。

利用CTCs與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性，對CTCs進(jìn)行動態(tài)檢測可用以評估輔助治療的療效，指導(dǎo)治療方案的調(diào)整及選擇[41，42]。Anemura等[43]采用ICC檢測16例胰腺癌新輔助放化療(吉西他濱、愛斯萬S-1聯(lián)合全劑量放療)前、新輔助放化療治療1個月后、手術(shù)切除后外周靜脈血CTCs，結(jié)果顯示截止新輔助放化療前，4例CTCs陽性者術(shù)后肝轉(zhuǎn)移率高于11例CTCs陰性者(50% vs. 0%)，此4例化療后CTCs持續(xù)升高，2例在R0切除后早期發(fā)生肝轉(zhuǎn)移并死亡，建議CTCs陽性患者選擇先手術(shù)再行化療的策略。

2.2 門靜脈CTCs的檢測及其預(yù)后評估價值

門靜脈CTCs的預(yù)后研究相對外周血較少，由于未經(jīng)肝臟濾過相對于外周血在CTCs檢出率上更具優(yōu)勢[44]，為CTCs的亞群研究、免疫抑制機(jī)制研究提供更多細(xì)胞來源[45]，目前尚無研究顯示門靜脈CTCs群落和外周血CTCs群落在分子表型上存在明顯差異。目前，門靜脈CTCs標(biāo)本常見的獲取方式有術(shù)中暴露門靜脈及其分支，抽取門靜脈循環(huán)血液標(biāo)本[46]以及通過超聲引導(dǎo)下肝穿刺從門靜脈系統(tǒng)中獲取標(biāo)本[47]2種方式。獲取標(biāo)本后CTCs的富集及鑒定技術(shù)基本同外周血CTCs。

門靜脈CTCs作為胰腺癌預(yù)后評估指標(biāo)的價值在多個研究中得到證實(shí)。Liu等[47]超聲引導(dǎo)下經(jīng)肝穿刺對晚期胰腺癌門靜脈血液中的CTCs進(jìn)行分析，29例門靜脈標(biāo)本均檢測到CTCs，轉(zhuǎn)移患者門靜脈CTCs平均為449.0/7.5 ml，明顯高于16例局部進(jìn)展期161.0/7.5 ml(P=0.0054),門靜脈CTCs高計數(shù)與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性；11例門靜脈CTCs低于150/7.5 ml，中位總生存期19.8周(95%CI: 16.8～25.4)，顯著長于17例門靜脈CTCs高于150/7.5 ml的中位總生存期9.2周(95%CI：7.8～11.8)，門靜脈CTCs>150/7.5 ml預(yù)示患者OS顯著縮短(log-rank檢驗(yàn)，P<0.0001)。

除此之外，門靜脈CTCs作為預(yù)后評估標(biāo)志物價值與外周血CTCs存在的差異在多個研究中報道，門靜脈血中CTCs的高表達(dá)與胰腺癌術(shù)后早期發(fā)生肝轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性[48，49]。Tien等[50]檢測41例PDAC體循環(huán)和術(shù)中門靜脈CTCs，術(shù)后每3個月復(fù)查肝臟MR，多因素分析顯示門靜脈CTCs的數(shù)量是術(shù)后6個月內(nèi)肝轉(zhuǎn)移的唯一獨(dú)立影響因子(OR=1.0122, 95%CI：1.0053～1.0226,P=0.0042)，術(shù)后早期肝轉(zhuǎn)移患者門靜脈CTCs計數(shù)顯著大于無早期肝轉(zhuǎn)移患者(402.94±838.77 vs 29.72±43.56，P<0.001),早期肝轉(zhuǎn)移與無早期肝轉(zhuǎn)移患者外周靜脈CTCs計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(61.18±112.48 vs.19.19±29.69,P=0.296)。

2.3 CTCs與胰腺癌預(yù)后相關(guān)性的分子生物學(xué)證據(jù)

隨著各種新型分子生物學(xué)層面檢測工具的應(yīng)用，CTCs的檢測流程已不再局限于CTCs的富集和鑒定計數(shù)，還可以對CTCs特異性腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行分子生物學(xué)參數(shù)測定，CTCs的具體測定工具及方法本文不再展開敘述。EMT等分子生物學(xué)改變被證實(shí)可提高腫瘤細(xì)胞的存活率和侵襲性[14]，多個CTCs相關(guān)的腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及組件在促進(jìn)腫瘤增殖、進(jìn)展的作用被發(fā)現(xiàn)，為CTCs表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性不斷提供新的分子生物學(xué)證據(jù)。楊靜等[51]對48例胰腺癌CTCs的研究結(jié)果顯示，胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)者TLR4、TLR9、myd88表達(dá)水平明顯高于未復(fù)發(fā)者(TLR4：3.16±1.02 vs.2.34±0.46；TLR9:3.34±1.09 vs. 2.68±0.65；myd88：2.76±0.67 vs.2.12±0.55；P<0.05)，CTCs中TLRs/myd88信號表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。近年來的研究顯示，TGFBI基因、KRAS突變基因、PD-L1、MUC-1、BIRC5等多個CTCs相關(guān)信號傳導(dǎo)組件的異常表達(dá)在胰腺癌及其他惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的潛在促進(jìn)作用[52～55]。

CTCs 在炎癥微環(huán)境中與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、PD-1(+)、CD8(+)T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的相互作用可促進(jìn)CTCs發(fā)生免疫逃逸[56～58]。Tao等[47]采用免疫熒光法檢測160例胰腺癌癌旁血管采集的血樣中CTCs，免疫熒光結(jié)果顯示PDAC患者腫瘤鄰近血管中CTCs被白細(xì)胞群落包圍，中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比例與術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(HR=2.15, 95%CI：1.279～3.615,P=0.004)，提示血液中CTCs與中性粒細(xì)胞可能通過某種相互作用而協(xié)助其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

盡管目前大部分同類研究中CTCs與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性得到肯定，但仍有部分研究得出陰性結(jié)果。Sergeant等[59]應(yīng)用RT-PCR檢測40例PDAC胰腺切除術(shù)外周血和腹腔積液EpCAM陽性腫瘤細(xì)胞，血液和腹腔積液EpCAM陽性腫瘤細(xì)胞的檢出與胰腺癌生存期無相關(guān)性(血液：log-rank檢驗(yàn)，P=0.17；腹腔積液：log-rank檢驗(yàn)，P=0.28) ，CTCs的預(yù)后評估價值目前仍存在一定的爭議。

3 結(jié)語

CTCs在循環(huán)中含量較少,內(nèi)部異質(zhì)性較大，對富集檢測技術(shù)要求較高。近年來，檢測技術(shù)不斷進(jìn)步，許多新型的檢測手段具有檢測過程高度自動化，可避免因CTCs表面標(biāo)志物下調(diào)所致的檢出率降低，能夠獲取大量有活性的CTCs，對CTC進(jìn)行多參數(shù)的分析等優(yōu)點(diǎn)。CTCs 與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性目前已在多個研究中得到初步驗(yàn)證，分子生物學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展也印證了CTCs作為預(yù)后評估標(biāo)志物的潛在價值。對CTCs的預(yù)后評估價值的研究應(yīng)開展更多大樣本、多中心、多參數(shù)、前瞻性的研究，制定標(biāo)準(zhǔn)化CTCs檢測方案及鑒定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步推動其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。