載巰基化阿霉素的中空金納米粒的制備與光熱性能研究

楊二爽，楊文倩，夏云，沈雁

(中國藥科大學藥學院，江蘇南京210009)

金納米粒(goldnanoparticles，AuNPs)是一種非常有前景的藥物載體，能夠有效地將藥物輸送到不同的細胞類型并釋放藥物。金納米粒作為藥物載體具有許多理想的特性［1-3］，例如化學性質惰性、良好的生物相容性。此外，金納米粒具有較大的比表面積，能夠以共價鍵和物理吸附的方式負載藥物。研究表明，空腔結構的金屬納米顆粒因為其特殊的結構而提供了較大的吸收截面，使得光熱轉換效率比實心金屬納米顆粒更高［4］，可以通過局部高溫有效地殺死癌細胞，在腫瘤治療中很有前景。

藥物與金納米粒相連，一般是經(jīng)過共價作用或非共價作用。采用非共價作用連接藥物-金納米粒的方法雖然簡單快捷，但是在生物體內的組織和細胞微環(huán)境中，結合在金納米粒表面的藥物分子并不十分穩(wěn)定。而通過共價作用連接的藥物-金納米粒則提高了藥物分子在體內環(huán)境的結合穩(wěn)定性。金納米粒易被巰基、氨基等基團修飾，所以某些分子結構中含有巰基的藥物可以與金納米粒形成Au-S共價鍵，直接結合到金納米粒表面，結構中不含巰基的藥物則需要通過一些化學修飾形成巰基，再結合到金納米粒表面［5］。因此，本實驗以抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)為模型藥物，通過化學修飾制備巰基化阿霉素(DOX-SH)，使之與中空金納米粒(HGNPs)相連，構成阿霉素-中空金納米粒復合載藥體系(HGNPs-DOX)，對其結構進行表征，并驗證其光熱轉化能力和細胞毒性。

1 儀器與材料

1．1 儀器 NewClassic電子天平ML系列(南京科翔儀器設備有限公司);85-1型磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司);RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);BHX型電熱恒溫鼓風干燥箱(南京科爾儀器設備有限公司);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);UPK-I-10T超純水機(成都超純科技有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);1KD透析袋(南京助研生物科技有限公司);752紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AVANCEAV-500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Agilent1100 LC/DAD/MSD液質聯(lián)用儀(美國Agilent公司);808 nm耦合激光器(寧波遠明激光技術有限公司)。1．2 藥品與試劑 鹽酸阿霉素(含量＞99%，批號：20150801，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司);三乙胺(AR，批號：20140728，國藥集團化學試劑有限公司);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，AR，批號：20160106，國藥集團化學試劑有限公司);乙酸乙酯(AR，批號：181017821K，南京化學試劑股份有限公司);氯化鈉(AR，批號：1801052，西隴化工股份有限公司);鹽酸羥胺(AR，批號：1706101，上海試四赫維化工有限公司);琥珀酰亞胺-S-乙?；虼宜狨?(SATA，＞94%，批號：160308，阿拉丁);氯金酸(AR，批號：180920，上海科峰實業(yè)有限公司);二水合檸檬酸三鈉(AR，批號：15011，南京化學試劑有限公司);硼氫化鈉(AR，批號：151029067F，南京化學試劑有限公司);氯化鈷(AR，批號：1708092，西隴科學股份有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，批號：181004，安徽山河藥輔有限公司);噻唑藍(MTT，批號：170209，江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

1．3 細胞 人非小細胞肺癌(A549，江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

2 實驗與方法

2．1 DOX-SH 的合成

2．1．1 DOX-SATA的合成 參考文獻中的制備方法［6］。精密稱取 10．5mgDOX 和 25．2mgSATA 置25mL茄形瓶中，加入3mLDMF使溶解，加入三乙胺6μL，用磁力攪拌器攪拌反應3h(避光)，反應后的溶液加入5mL水進行稀釋，用乙酸乙酯進行萃取，用飽和食鹽水洗滌，于旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)濃縮，40℃真空干燥。得到DOX-SATA，稱重，除以理論產量，計算回收率。

2．1．2 DOX-SH 的合成 參考文獻中的制備方法［4］。取純化后的第一步反應產物DOX-SATA適量，溶于甲醇中，加入鹽酸經(jīng)胺(DOX-SATA和鹽酸羥胺的摩爾比為1∶100)，加入適量三乙胺調節(jié)pH為7．4，氮氣保護，避光反應12h。旋轉蒸發(fā)除去大部分有機溶劑，40℃真空干燥，得到DOX-SH，稱重除以理論產量，計算回收率。

2．2 DOX-SH 的表征

2．2．1 質譜 分別取 DOX、DOX-SATA、DOX-SH 適量，以CD3OD為溶劑，進行質譜分析，記錄MSESI圖譜。分析DOX、DOX-SATA、DOX-SH的分子量。

2．2．2 氫譜 分別取 DOX、DOX-SATA 適量，以CD3OD為溶劑，頻率500MHz，測試溫度為25℃，進行氫譜分析，記錄1H-NMR圖譜。分析DOX、DOXSATA的特征氫化學位移。

2．3HGNPs-DOX 的制備

2．3．1 HGNPs的制備 在500mL三頸燒瓶中加入300mL 超純水，依次加入 6mL0．05mol·L-1的檸檬酸三鈉溶液、300μL20%PVPK30溶液和300 μL0．4mol·L-1的氯化鈷溶液，抽真空。加入3mL 0．1mol·L-1的硼氫化鈉溶液，變色后攪拌 15min，使過量的硼氫化鈉迅速水解產生氫氣;加入900μL 25mmol·L-1氯金酸溶液，30s后通入空氣攪拌5 min，使剩余的內部鈷納米粒核心被氧化，即得HGNPs溶液［7］。

2．3．2 HGNPs-DOX的制備 取一定量 HGNPs溶液置10mL離心管中，向HGNPs溶液中加入適量DOX-SH溶液，在37℃下孵育8h。將孵育結束后的HGNPs-DOX溶液轉移至10mL離心管中，10000rpm離心15min，棄去上清液中未反應的DOX-SH，用超純水復溶［8］。

2．4HGNPs-DOX 的表征

2．4．1 HGNPs-DOX的粒徑分布和Zeta電位 取3 mLHGNPs-DOX溶液，使用激光粒度分析儀測定樣品的粒徑分布和Zeta電位，每個樣品測定3次。

2．4．2 等離子共振(SPR)吸收峰 取制備好的HGNPs和HGNPs-DOX溶液3mL，以超純水作為空白溶液。采用紫外分光光度計測定溶液的等離子共振吸收峰和吸收光譜。測量波長范圍為400nm至1000nm。

2．4．3 HGNPs-DOX的形態(tài)表征 利用TEM 觀察HGNPs-DOX的形態(tài)。吸取少量HGNPs、HGNPs-DOX溶液(5mg·mL-1)滴在碳支持膜表面，2～3 min后用濾紙吸去殘留液體，將樣品置于紅外燈下干燥，使用TEM觀察形態(tài)特征。

2．4．4 HGNPs-DOX的體外光熱轉化能力 分別配制 0．075、0．15 和 0．30mmol·L-1的 HGNPs 和HGNPs-DOX溶液，各取1mL置石英比色皿中，使用808nm波長激光以1W·cm-2的功率照射10 min，每隔1min使用紅外熱成像儀記錄溫度變化(以pH7．4磷酸鹽緩沖液作為對照)。另取0．30 mmol·L-1的HGNPs-DOX溶液，使用808nm波長激光以1W·cm-2照射2．5min，記錄溫度值，并冷卻至室溫，重復10次，記錄每次溫度變化。

2．4．5 細胞毒性實驗 采用 MTT法考察 DOX和HGNPs-DOX的體外細胞毒性和激光照射后HGNPs-DOX的細胞毒性。將生長狀態(tài)處于對數(shù)生長期的A549細胞加入96孔板中，使每孔大約1×105個細胞。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，加入含相同DOX濃度的DOX、HGNPs-DOX溶液，每孔加入200μL，另設置HGNPs-DOX組別，給予1W·cm-2的近紅外光照射5min。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL0．5mg·mL-1的 MTT 溶液。培養(yǎng) 4h 后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，于490nm測定各樣品吸光度(A樣品)。同時測定調零孔(A空白)和對照孔(A對照)的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

3 結果與討論

3．1 DOX-SH 的合成

3．1．1 DOX-SATA的合成 以 DOX和 SATA為原料，在三乙胺的催化下，SATA上琥珀酰亞胺和DOX的伯胺根據(jù)確定的摩爾比反應生成DOX-SATA，反應式見圖1。產物為紅色粉末狀固體，不溶于水，溶于甲醇等有機溶劑。產率為90．42%。

圖1 DOX-SATA和DOX-SH的合成

3．1．2 DOX-SH的合成 DOX-SATA的乙酰基硫代乙酸酯在鹽酸羥胺的作用下脫去乙?；鶊F，最終在DOX分子上連接游離的巰基基團，反應式見圖1。產物為紅色粉末狀固體，不溶于水，溶于甲醇等有機溶劑。產率為78．53%。

3．2 DOX-SH 的表征

3．2．1 質譜 DOX、DOX-SATA和DOX-SH的質譜圖見圖2。由DOX和DOX-SATA的質譜圖可以看出，DOX的分子離子峰為544．2，DOX-SATA的分子離子峰是659．2，相差一個硫酯基團的分子量，說明硫酯基團連接到DOX上，結果與理論值相符合。而DOX-SH中出現(xiàn)了616．6的分子離子峰，與DOX-SATA的分子離子峰相差43，為脫去的乙酰基的分子量，與文獻相符。DOX-SH的質譜圖中，出現(xiàn)了大于616的分子離子峰，推測可能是DOX-SH在反應過程中，巰基被氧化，形成了二硫鍵，DOX-SH分子之間發(fā)生了交聯(lián)。

圖2 質譜圖

3．2．2 氫譜 DOX和DOX-SATA的1H-NMR譜圖見圖3。與DOX的譜圖相比，DOX-SATA的譜圖中在2．5ppm左右出現(xiàn)了兩個新的質子峰，此為硫酯基團上的質子峰，證明合成的產物中含有硫酯基團。結果與文獻相符。

圖3 1H-NMR譜圖

3．3HGNPs-DOX 的制備

3．3．1 HGNPs的制備 采用鈷模板法制備了 HGNPs，其外觀如圖4(a)所示，所制備的HGNPs呈透明澄清的綠色。外觀均一，無沉淀出現(xiàn)。

圖4 HGNPs和HGNPs-DOX外觀圖

3．3．2 HGNPs-DOX的制備 采用鈷模板法制備了中空金納米粒，其外觀如圖4(b)所示，所制備的HGNPs-DOX呈透明澄清的灰色，無聚集顆粒或者沉淀出現(xiàn)，外觀均一，與HGNPs相比，顏色偏灰。

3．3．3 HGNPs-DOX 的粒徑分布和 Zeta 電位

HGNPs和HGNPs-DOX的粒徑分布見圖5。HGNPs的粒徑為(53．00±0．196)nm，Zeta 電位為(-55．44±3．88)mV;與 HGNPs相比，HGNPs-DOX 的粒徑稍有增加為(72．00±0．131)nm，Zeta 電位為(-39．51±3．62)mV。HGNPs和HGNOPs-DOX的粒徑逐漸增大。

3．3．4 等離子共振(SPR)吸收峰 如圖6所示，所制備的HGNPs等離子共振吸收(SPR)吸收峰最大吸收波長為780nm左右;HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長為800nm。金納米粒可以吸收近紅外光，這使其可以將光能轉化為熱能。而SPR最大吸收波長在808nm附近的HGNPs，光熱轉化的效率更高。以上結果表明，HGNPs和HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長為800nm左右。HGNPs、HGNPs-DOX的SPR吸收峰最大吸收波長依次出現(xiàn)紅移。

圖5 粒徑分布

圖6 吸收光譜圖

3．3．5 HGNPs-DOX 的形態(tài)表征 HGNPs 和HGNPs-DOX在透射電鏡下的形態(tài)圖見圖7?？梢钥闯鲋苽浜玫腍GNPs外形呈圓球形，內部具有空腔結構，其粒徑約為50nm左右，殼厚為4～6nm，這與實際測得的粒徑也相符合。HGNPs-DOX仍然呈現(xiàn)出空腔結構的圓球形，但在其外表有一層透明的膜狀物，其厚度大約為5nm左右。HGNPs-DOX的粒徑大于HGNPs，一方面是因為阿霉素負載到其表面，另一方面可能是由于阿霉素的負載，使得HGNPs表面水化層的存在。

圖7 透射電鏡下的形態(tài)圖

圖8 HGNPs(a)和HGNPs-DOX(b)的溫度變化與重復10次照射后HGNPs和HGNPs-DOX(c)的溫度變化

3．3．6 HGNPs-DOX的體外光熱轉化能力 由圖8可以看出，HGNPs和HGNPs-DOX的體外光熱轉化能力呈時間依賴和劑量依賴性。在較低濃度時，與PBS相比，HGNPs和HGNPs-DOX在808nm波長激光照射下，其溫度隨時間的延長而顯著增加。且溫度變化隨濃度的增加而增加。而HGNPs和HGNPs-DOX相比，兩者在不同濃度下的溫度增加無明顯差異。采用808nm波長激光照射2．5min，并重復10次，可以看出HGNPs和HGNPs-DOX在每次照射以后達到的最高溫度都在60℃左右，且HGNPs和HGNPs-DOX的溫度變化無顯著性差異。這提示在多次照射以后，金納米粒的光熱轉化能力并不會降低。以上結果表明，制備得到的HGNPs-DOX可以將光能轉化為熱能，具有良好的體外光熱性能，這為其后期的熱療研究提供了可能。

3．3．7 細胞毒性 加入DOX、HGNPs-DOX的細胞存活率見圖9所示?？梢钥闯?，DOX對A549細胞具有較大的毒性，其 IC50為 11．24μg·mL-1。在較高濃度下，中空金納米粒能有效地降低阿霉素對細胞的毒性。采用1W·cm-2的近紅外光照射5min以后，在高濃度下，其細胞毒性增加，可能是由于在近紅外光的照射下，阿霉素從載體中釋放出來。而較低濃度時細胞毒性無明顯變化，可能是由于在濃度較低時，阿霉素的細胞毒性較小。以上結果表明，將阿霉素負載到HGNPs上，能顯著降低阿霉素的毒性，且在近紅外光的照射下能夠促進阿霉素的釋放，使得細胞存活率降低。

圖9 DOX、HGNPs-DOX的細胞存活率(n=6，*P＜0．05，＊＊P＜0．01)

4 小結

本實驗采用SATA試劑制備了DOX-SH，該方法操作簡單，合成過程副反應較少，產率較高，方法較為可行。制備了HGNPs-DOX，其粒徑70nm左右，粒徑均一，分散性能良好，最大吸收波長為800 nm左右，光熱轉化實驗證明該材料具有很好的光熱性能，細胞毒性實驗表明該材料具有較小的毒性，且近紅外光的照射能夠促進DOX的釋放。本研究為金納米粒載藥系統(tǒng)研究用模型藥物的巰基化，提供了一種較為可行的合成方法。其次，HGNPs-DOX載藥體系可以用于化療聯(lián)合熱療研究，具有極大的研究價值。