鹽酸賽庚啶在Caco-2細(xì)胞中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究

金永華，劉健，劉卉芳，李文娟，童煥，王湛博，楊勇，吳玉林

(1．中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇南京211198;2．中國藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，江蘇南京211198)

體內(nèi)生物等效(bioequivalence，BE)是證明仿制藥和原研藥等效的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但人體等效性試驗(yàn)費(fèi)用高、耗時(shí)長且采用健康志愿者，面臨倫理學(xué)問題。如何采用體外方法代替人體等效性試驗(yàn)是制藥界和藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)一直努力探索的問題［1-2］?？紤]到溶出度、溶解性和腸道內(nèi)的滲透性是影響常釋口服制劑在體內(nèi)吸收速度和程度的3個(gè)主要因素，Amidon等［3］于1995年提出生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceuticsclassificationsystem，BCS)的概念，根據(jù)溶解度和滲透性將藥物分為4類，即BCS1類，高溶解性-高滲透性;BCS2類，低溶解性-高滲透性;BCS3類，高溶解性-低滲透性;BCS4類，低溶解性-低滲透性。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)［4］、歐洲藥品管理局(EMA)［5］、世界衛(wèi)生組織(WHO)［6］等監(jiān)管機(jī)構(gòu)分別出臺(tái)了基于生物藥劑學(xué)系統(tǒng)分類(BCS)豁免的指導(dǎo)原則。2016年原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《人體生物等效性試驗(yàn)豁免指導(dǎo)原則》［7］，明確指出對(duì)于BCS1類和3類的藥物，只要處方中的其他輔料成分不顯著影響API的吸收，則不必證明該藥物在體內(nèi)生物利用度和生物等效的可能性，即生物等效性豁免。對(duì)于通透性的研究可以采用單層人工培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，Caco-2方法簡單、易行、成本低廉，常用于研究藥物的滲透性。

鹽酸賽庚啶片為藥品審評(píng)中心(CDE)公布的豁免名單草案中明確豁免BE的品種，但正式公布豁免名單時(shí)卻將其剔除。本實(shí)驗(yàn)通過建立Caco-2細(xì)胞模型，研究鹽酸賽庚啶在小腸上皮細(xì)胞的攝取、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及外排作用，闡明鹽酸賽庚啶的吸收機(jī)制，為其能否生物豁免提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器 對(duì)照品：賽庚啶 (委托方提供);法莫替丁(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100305-201304);普萘洛爾 (Sigma-Aldrich，批號(hào)：BCBV9430);地高辛(TokyoChemicalIndustry，批號(hào)：MERKG-DL);沙丁胺醇(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100204-201103);甲苯磺丁脲(Sigma-Aldrich，批號(hào)：BCBV8457)。

材料和試劑：Caco-2細(xì)胞株(中國科學(xué)上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，批號(hào)：HTB-37);MEM培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)：C11095500BT);胎牛血清(BI，批號(hào)：04-001-1ACS);HBSS 溶 液 (Hyclone，批 號(hào)：SH30030．02);雙 抗(Hyclone，批號(hào)：SV30010);0．25%胰酶(Gibco，批號(hào)：25200-072);丙酮酸鈉(Gibco，批號(hào)：11360-070);非必需氨基酸(Gibco，批號(hào)：11140-050);L-谷氨酰胺(Gibco，批號(hào)：25030-081);依克立達(dá)(TargetMol，批號(hào)：T2657);4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma-Aldrich，批號(hào)：H4034);氯化鈉(西隴科學(xué)，批號(hào)：180329);氯化鉀(上海凌峰，批號(hào)：20170111);十二水合磷酸氫二鈉(西隴科學(xué)，批號(hào)：171220);磷酸二氫鉀(上海凌峰，批號(hào)：20170122);熒光黃二鉀鹽(Sigma-Aldrich，批號(hào)：L0144);RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天，批號(hào)：P0013K)。甲醇、乙腈為色譜純，購自Merck公司，其他溶劑和試劑均為分析純或以上。

儀器和耗材：Millicell小室(Merck，型號(hào)：MCRP24H48);細(xì)胞培養(yǎng)板(Sunub，型號(hào)：TCP-24);離心機(jī)(Dragonlab，型號(hào)：DM0412);數(shù)顯恒溫水浴鍋(DFS，型號(hào)：HH-4);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)：3111);生物安全柜(Thermo，型號(hào)：1384);多功能酶標(biāo)儀(En-Spire，型號(hào)：2300);生物倒置顯微鏡(Olympus，型號(hào)：CKX31);跨膜電阻儀(Millicell-ERS)。

1．2 Caco-2細(xì)胞模型的建立和評(píng)價(jià) Caco-2細(xì)胞以1×105/cm2的密度接種于Millicell懸掛式培養(yǎng)小室中，于接種后的第21天使用Millicell-ERS跨膜電阻儀測定Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻值。檢測Caco-2細(xì)胞滲透性：測定300μmol·L-1熒光黃AP-BL側(cè)的通透性。

1．3 熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定 稱取適量熒光黃溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配成300mmol·L-1母液，臨用前用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)稀釋至300μmol·L-1工作液，用于測定Caco-2細(xì)胞致密性。后逐級(jí)稀釋熒光黃儲(chǔ)備液配制成1000、500、100、50、10、5nmol·L-1，線性回歸計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光黃的測定采用PerkinElmer多功能酶標(biāo)儀，激發(fā)波長425nm，發(fā)射波長528nm，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光黃透過率。

1．4 給藥液與接收液的配制 供試品和對(duì)照品分別稱取適量，溶于DMSO配成100mmol·L-1儲(chǔ)備液，臨用前稀釋。Elacridar配制成50mmol·L-1母液，臨用前稀釋，具體配制方法見表1。

表1 溶液配置方法

1．5 轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn) 生長在Millicell培養(yǎng)小室中的細(xì)胞培養(yǎng)23d時(shí)，選取細(xì)胞電阻值大于300Ω的小室進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。棄去小室培養(yǎng)基，用已預(yù)熱的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液將細(xì)胞清洗3遍，第三次加入后置于培養(yǎng)箱中溫孵20min。對(duì)于AP-BL：分別于AP側(cè)加入200μL頂端給藥液，于BL側(cè)加入1000μL基底端接收液;BL-AP：分別于AP側(cè)加入200μL頂端接收液，于BL側(cè)加入1000μL基底端給藥液。將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2和95%相對(duì)濕度條件下孵育，分別收集接收側(cè)在60、90和120min的溶液100 μL，同時(shí)補(bǔ)加100μL空白接收液，其中120min膜兩側(cè)均取樣100μL，用于計(jì)算回收率。

起始給藥液即為T0樣品，取完樣后吸棄細(xì)胞板內(nèi)剩余的溶液，加入終止液200μL裂解細(xì)胞，輕輕震搖5min后收集細(xì)胞裂解液。

1．6 樣品分析

1．6．1 HBSS緩沖液中賽庚啶的檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測條件：色譜柱為Poroshell120 PhenylHexyl(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱溫為 35 ℃;流動(dòng)相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流動(dòng)相B：甲醇;梯度洗脫：0．0～0．6min 為 10%B，0．6～1．0min 為 10%B→80%B，1．0～3．0min 為 80%B，3．10～4．0min 為 10%B;運(yùn)行時(shí)間：4．0min;流速為 0．3mL·min-1;進(jìn)樣量為 5．0 μL。采用MRM模式;離子化方式為電噴霧離子化;離子極性為正離子;離子化電壓為5500V;溫度為500℃;氣簾氣為15psi;霧化氣為25psi;渦輪氣為25psi。賽庚啶和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。前處理方法：精密移取20μL樣品于1．5mLEP管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，再加入180μL甲醇，渦旋混勻，20000g，4 ℃，離心 5min，取 80 μL上清液與80μL純化水，混勻后進(jìn)樣。

表2 賽庚啶的質(zhì)譜檢測參數(shù)

1．6．2 HBSS緩沖液中法莫替丁、普萘洛爾和地高辛的檢測 法莫替丁的LC-MS/MS檢測條件：色譜柱為 ZorbaxSB-C8，(3．5 μm，150mm×4．6mm);柱溫為40℃;流動(dòng)相 A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流動(dòng)相 B：甲醇;等度洗脫：0．0～3．5min 為 40%B;運(yùn)行時(shí)間：3．5min;流速為 0．8mL·min-1;進(jìn)樣量為5．0μL。離子檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測;離子化方式為電噴霧離子化;離子極性為正離子;離子化電壓為5000V;溫度為450℃;氣簾氣為28psi;霧化氣為55psi;渦輪氣為50psi。法莫替丁和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)見表3。

表3 法莫替丁的質(zhì)譜檢測參數(shù)

普萘洛爾的LC-MS/MS檢測條件：色譜柱為Poroshell120PhenylHexyl，(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱溫為35℃;流動(dòng)相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流動(dòng)相 B：甲醇;梯度洗脫：0．0～0．8min 為 20%B，0．8～1．1min 為 20%B→70%B，1．1～2．0min 為 70%B，2．10～3．5min 為 20%B;運(yùn)行時(shí)間：3．5min;流速為 0．5 mL·min-1;進(jìn)樣量為5．0μL。離子檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測;離子化方式為電噴霧離子化;離子極性為正離子;離子化電壓為5000V;溫度為450℃;氣簾氣為28psi;霧化氣為55psi;渦輪氣為50psi。普萘洛爾和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)見表4。

地高辛的LC-MS/MS檢測條件：色譜柱為Poroshell120PhenylHexyl(2．7 μm，50mm×2．1mm);柱溫為35℃;流動(dòng)相A：0．1%甲酸的水溶液(V/V)，流動(dòng)相 B：甲醇;梯度洗脫：0．0～0．8min 為 20%B，0．8～1．1min 為 20%B→70%B，1．1～2．0min 為 70%B，2．10～3．5min 為 20%B;運(yùn)行時(shí)間：3．5min;流速為 0．5 mL·min-1;進(jìn)樣量為5．0μL。離子檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測;離子化方式為電噴霧離子化;離子極性為正離子;離子化電壓為-4500V;溫度為550℃;氣簾氣為20psi;霧化氣為50psi;渦輪氣為60psi。地高辛和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜檢測參數(shù)見表5。

表4 普萘洛爾的質(zhì)譜檢測參數(shù)

表5 地高辛的質(zhì)譜檢測參數(shù)

法莫替丁樣品的前處理方法：取30μL樣品加入150μL內(nèi)標(biāo)工作液(沙丁胺醇)，渦旋5min，20000g，4℃離心10min，取上清液100μL與100 μL水混合，渦旋10min，LC/MS/MS分析。

普萘洛爾和地高辛樣品的前處理方法：取30μL樣品加入270μL內(nèi)標(biāo)工作液(甲苯磺丁脲)，渦旋5 min，20000g，4 ℃離心 10min，取上清液 100 μL 與100μL水混合，渦旋10min，LC/MS/MS分析。

1．7 數(shù)據(jù)計(jì)算 采用如下公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)(Papp，cm·s-1)，外排率以及回收率。

Papp=

熒光黃透過到基底端的百分率用以下公式計(jì)算：

RFUApical和RFUBasolaterd分別是熒光黃在頂端和基底端的相對(duì)熒光強(qiáng)度。VApical和VBasolaterd分別是頂端和基底端的上樣體積(分別為0．2mL和1mL)。

2 結(jié)果

2．1 賽庚啶HBSS緩沖液中方法學(xué)驗(yàn)證 選擇性：在該試驗(yàn)條件下，賽庚啶的出峰時(shí)間為2．21min，內(nèi)標(biāo)甲苯磺丁脲的出峰時(shí)間為2．09min?？瞻讟颖尽①惛ひ约皟?nèi)標(biāo)的選擇性色譜圖見圖1。

殘留：在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)(ULOQ)后，進(jìn)樣空白樣本，未見空白樣本中有殘留干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)待測物濃度作權(quán)重回歸計(jì)算，選1/c2為權(quán)重因子得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，鹽酸賽庚啶：Y=0．000924X+0．00223，r=0．9959(n=8)。表明鹽酸賽庚啶在 10～5000nmol·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。鹽酸賽庚啶LLOQ為10nmol·L-1，準(zhǔn)確度為 93．3% ～ 104．0%，RSD 為4．0%。

稀釋效應(yīng)：超限樣品(1000nmol·L-1)稀釋10倍后進(jìn)樣分析，結(jié)果，樣品準(zhǔn)確度在 101．5%～107．2%之間，RSD 在 2．1%～15．0%之間。

準(zhǔn)確度和精密度：制備濃度為30、200、4000 nmol·L-1的樣品，考察準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果準(zhǔn)確度在 104．6%～107．0%之間，精密度在 6．1%～8．2%。2．2 Caco-2細(xì)胞單層生長過程中跨膜電阻值的變化及熒光黃的測定 Caco-2細(xì)胞接種到小室后，TEER值隨著接種的時(shí)間逐漸增大，到第3周時(shí)TEER值增長緩慢。第21天測定各小室的TEER值，均已超過300Ω·cm2。隨機(jī)抽取6個(gè)小室進(jìn)行熒光黃測定，熒光黃的透過率均小于2．5%左右，表明本實(shí)驗(yàn)中Caco-2細(xì)胞單層模型的致密性良好。2．3 對(duì)照品法莫替丁、普萘洛爾和地高辛細(xì)胞單層的滲透性結(jié)果 Caco-2細(xì)胞單層致密連接形成后，法莫替丁(50μmoL·L-1)、普萘洛爾(50 μmoL·L-1)的細(xì)胞單層滲透性結(jié)果見表6。地高辛的外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表6 法莫替丁和普萘洛爾滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 地高辛的外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果

作為低滲的對(duì)照藥，法莫替丁的平均表觀滲透系數(shù)［Papp(A-B)］為 2．99×10-6cm·s-1;作為高滲的對(duì)照藥，普萘洛爾的平均表觀滲透系數(shù)［Papp(AB)］為20．52×10-6cm·s-1(見表6)。作為外排轉(zhuǎn)運(yùn)的對(duì)照藥，不加抑制劑時(shí)，地高辛的平均表觀滲透系數(shù) Papp(A-B)和 Papp(B-A)值分別為 1．65×10-6cm·s-1和7．56×10-6cm·s-1，外排率為4．57;加入抑制劑時(shí)，地高辛的平均表觀滲透系數(shù)Papp(A-B)和Papp(B-A)值分別為 2．54×10-6cm·s-1和 2．47×10-6cm·s-1，外排率為0．97(見表7)。對(duì)照藥的溶液回收率為 68．32% ～124．35%，總回收率為 83．90% ～128．04%。因此本研究所采用的Caco-2細(xì)胞展示出合格的功能特性。

2．4 賽庚啶雙向滲透性結(jié)果 Caco-2細(xì)胞單層致密連接形成后，鹽酸賽庚啶(5、10和 20 μmoL·L-1)的細(xì)胞單層滲透性結(jié)果見表2。

在給藥濃度為5、10和20μmoL·L-1及不含抑制劑的條件下，鹽酸賽庚啶在A-B方向的平均表觀滲透系數(shù)分別為 6．36×10-6、6．14×10-6、23．1×10-6cm·s-1。在B-A方向的平均表觀滲透系數(shù)分別為16．7×10-6、18．16×10-6、29×10-6cm·s-1，外排率REa，分別為 2．63、2．96、1．26。在給藥濃度 5、10 和20μmoL·L-1及含抑制劑的條件下，鹽酸賽庚啶在A-B方向的平均表觀滲透系數(shù)分別為7．74×10-6、15．06×10-6、26．96×10-6cm·s-1。在 B-A 方向的平均表觀滲透系數(shù)分別為 14．03×10-6、18．51×10-6、21．3×10-6cm·s-1。外排率 REi分別為 1．81、1．23、0．79。鹽酸賽庚啶Caco-2細(xì)胞中表現(xiàn)出較好的滲透性，同時(shí)可能存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象，為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 賽庚啶滲透性及外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

鹽酸賽庚啶片為CDE公布的豁免名單草案中明確豁免BE的品種，但正式公布豁免名單時(shí)卻將其剔除。溶解性試驗(yàn)中已明確鹽酸賽庚啶為高溶解性物質(zhì)，對(duì)于滲透性的考察，高濃度(20μmoL·L-1)表現(xiàn)出高滲透性，當(dāng)濃度為5、10μmoL·L-1時(shí)，滲透系數(shù)較20μmoL·L-1下降，同時(shí)外排率大于2，存在外排現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用依克立達(dá)作為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，依克立達(dá)為P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)轉(zhuǎn)運(yùn)體底物，加入依克立達(dá)后，外排率降低，說明鹽酸賽庚啶可能是P-gp和BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)體底物。而采用Caco-2方法進(jìn)行滲透性研究僅適用于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物(藥物的外排率應(yīng)小于2)［8］。從鹽酸賽庚啶的滲透性結(jié)果可以看出，滲透隨藥物濃度的變化而變化，且與轉(zhuǎn)運(yùn)方向有關(guān)。推測未將鹽酸賽庚啶作為BE豁免品種可能與其在Caco-2細(xì)胞中存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象有關(guān)。