柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊的制備及體外評價

王章姐，劉自平，許 燕，尹 偉

安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，合肥 230088

柚皮素(naringenin)是柚皮苷的苷元，屬二氫黃酮類化合物，廣泛存在于薔薇科植物的花蕾中，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、解痙和利膽等多方面藥理作用。柚皮素幾乎不溶于水，常規(guī)口服劑型生物利用度較低、半衰期短，可通過改進其口服劑型，提高水溶性，延長半衰期，從而達(dá)到提高生物利用度的目的[1-3]。

1982年，日本學(xué)者Kawashima發(fā)明了球晶造粒技術(shù)(spherical crystallization technique)，并用該技術(shù)在液相中通過一個步驟即完成了水楊酸的結(jié)晶、析出和凝聚成粒等過程[4]。該技術(shù)流程簡單、所用設(shè)備少，簡化了傳統(tǒng)制粒工藝，改善了藥物顆粒的粉體流動性、填充性和壓縮成形性，制成的顆粒可直接用于壓片。球晶造粒技術(shù)關(guān)鍵在于溶劑系統(tǒng)的選擇，原則上為3溶劑系統(tǒng)：架橋劑、良溶劑和不良溶劑，根據(jù)藥物的理化性質(zhì)有時不需架橋劑，僅采用良溶劑和不良溶劑系統(tǒng)就可完成。選擇合適的溶劑系統(tǒng)，將自微乳作為主藥，利用球晶造粒技術(shù)將其在液相中一步固化成粒，可構(gòu)建出穩(wěn)定性高、載藥量大的固體自微乳釋藥系統(tǒng)。

滲透泵制劑因其顯著的釋藥特性，已經(jīng)成為理想的一種控釋制劑。其釋藥動力來源于滲透泵膜內(nèi)外的滲透壓差，在機體內(nèi)不易受酸、堿、酶及食物等因素的影響，能維持長時間恒速釋藥，表現(xiàn)為零級釋藥特征[5]。不對稱膜(asymmetric membrane，AM)是指一種斷面結(jié)構(gòu)不相對稱的半透膜，由基底層和表皮層兩部分組成。其中，基底層較厚且具有疏松的海綿狀多孔，主要起支撐和抗壓作用，其厚度決定膜的機械強度；表皮層為活性控釋層，薄且致密，可控制水分滲透、減少時滯時間、促進藥物釋放[6]。以AM作為半透膜制成新型滲透泵制劑，可顯著提高難溶性藥物的釋放速率，且具有高選擇性、高滲透性、高水通量以及良好體內(nèi)外相關(guān)性的特點[7]。本研究運用球晶造粒技術(shù)和不對稱膜技術(shù)制備柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊，可提高難溶性藥物柚皮素的水溶性和生物利用度，保證藥物在低滲透壓和低溶解度條件下完全釋藥，解決難溶性藥物制成滲透泵釋藥不完全的問題，制劑工藝簡單，使得自微乳滲透泵控釋膠囊在緩控釋領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CHY-C2A薄膜測厚儀，濟南蘭光機電技術(shù)有限公司；AS3120型超聲清洗器，Autoscience公司；CP2115D電子天平，Satorius公司； 85-2 恒溫磁力攪拌器，金壇市金分儀器有限責(zé)任公司；HH-S2恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；ZEN 3690 Malvern粒徑電位測定儀，英國馬爾文儀器有限公司；HT7700-SS 透射電子顯微鏡，日本日立公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀；美國安捷倫公司；Agilent G1315A 紫外檢測器，美國安捷倫公司；XB C18色譜柱(Welch ,250 mm×4.6 mm,5μm)； Heraeus Multifuge X1R 離心機，賽默飛世爾科技公司；ZRS 8G智能溶出儀，天津大學(xué)無線電廠。

1.2 材料與試劑

柚皮素原料，批號20160725，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，成都康輝生物科技有限公司；柚皮素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號120546-201409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%；醋酸纖維素(CA)，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)；乙基纖維素(EC，10cp)，卡樂康公司；微粉硅膠(SiO2)，安徽山河藥用輔料有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，安徽山河藥用輔料有限公司；硬脂酸鎂(MS)，安徽山河藥用輔料有限公司；滑石粉，安徽山河藥用輔料有限公司；水為超純水；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定條件與方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為C18柱(300 mm×3.9 mm，4 μm)，流動相為甲醇：水：冰醋酸(49∶50∶1)，檢測波長288 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取柚皮素對照品儲備液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻得質(zhì)量濃度為25.5、51.0、76.5、102、127.5 μg/mL的對照品溶液，分別取上述對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積積分值(Y)對柚皮素質(zhì)量濃度(X)作線性回歸，得回歸方程為y=70 368x-46 758，R2=0.999 9，表明柚皮素在25.5～127.5 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.3 釋放度測定

參照《中華人民共和國藥典》2015年版第四部通則0931釋放度測定第二法，采用溶出度測定第一法的裝置[9]，測定柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊的體外累積釋放度。釋放介質(zhì)為經(jīng)脫氣處理的雙蒸水900 mL(含0.5%SDS)，轉(zhuǎn)速75 rpm，釋放介質(zhì)溫度恒定在(37±0.5)℃。于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別取樣5 mL，并補充等體積同溫釋放介質(zhì)，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液稀釋至適宜濃度，于288 nm處測定峰面積，計算藥物累積釋放度。

2.2 柚皮素自微乳的制備

在前期研究基礎(chǔ)上[8]，精密稱取51 g聚山梨酯80，33 g PEG400，16 g油酸乙酯，混勻后加入35 g柚皮素原料，置超聲清洗儀中超聲振蕩使柚皮素充分溶解，即得柚皮素自微乳。

2.3 柚皮素固體自微乳的制備

運用球晶造粒技術(shù)制備柚皮素固體自微乳，將盛有不良溶劑的燒杯置恒溫水浴鍋中，精密稱取處方量的柚皮素自微乳，溶于良溶劑和架橋劑溶液中，再加入一定量的分散載體形成均勻混懸液，在恒溫、攪拌的條件下倒入盛有不良溶劑的燒杯中，持續(xù)恒溫攪拌30 min，即得。

2.4 球晶造粒技術(shù)篩選固體自微乳處方

2.4.1 分散載體的考察

固定其他處方和工藝條件，分別選擇滑石粉、微粉硅膠、硬脂酸鎂為分散載體，考察其對柚皮素固體自微乳成球性的影響。由表1可知，滑石粉不易成球，微粉硅膠和硬脂酸鎂均可成球，但成球形態(tài)有所差異，微粉硅膠成球效果優(yōu)于滑石粉和硬脂酸鎂，選擇微粉硅膠作為分散載體。

表1 分散載體對于成球性的影響Table 1 The effects of dispersion carriers on the microspheres

2.4.2 不良溶劑用量考察

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇液體石蠟作為不良溶劑，以產(chǎn)率為指標(biāo)，考察其用量。由實驗可知，液體石蠟體積在100 mL和125 mL時得球率相對較高，且兩者相差不大，故選擇液體石蠟體積為100 mL。

2.4.3 良溶劑用量考察

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇無水乙醇作為良溶劑，以產(chǎn)率為指標(biāo)，考察其用量，選擇利于成球的最佳良溶劑系統(tǒng)。從實驗結(jié)果可以看出，當(dāng)無水乙醇用量為7 mL時自微乳濃度達(dá)到飽和狀態(tài)，收率最高，故乙醇最佳用量選擇7 mL。

2.4.4 系統(tǒng)溫度的考察

系統(tǒng)溫度會影響自微乳的穩(wěn)定性，同時對成球性也有一定的影響，根據(jù)預(yù)實驗，設(shè)定系統(tǒng)溫度的范圍18～40 ℃，選擇有利于成球的最佳溫度。通過實驗可知，反應(yīng)溫度對于收率影響比較顯著，溫度在25 ℃時收率最高，故選擇25 ℃作為系統(tǒng)溫度。

2.4.5 攪拌時間的選擇

以產(chǎn)率為指標(biāo)，考察攪拌時間對制備柚皮素固體自微乳的影響。當(dāng)攪拌時間為30 min時，成球率有較大提升，繼續(xù)增加攪拌時間至40、50 min 收率基本無變化，因此設(shè)定攪拌時間為30 min。

2.4.6 攪拌速度的選擇

考察不同轉(zhuǎn)速對成球性能的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)速在300～500 rpm時收率變化不大，轉(zhuǎn)速在400 rpm時相對較高，且隨著攪拌速度的加快，顆粒直徑逐漸變小，產(chǎn)率略有下降，所以選擇400 rpm作為攪拌速度。

2.5 柚皮素固體自微乳的質(zhì)量評價

2.5.1 柚皮素固體自微乳形態(tài)

取柚皮素固體自微乳約1 g，于37 ℃水浴加入100倍同溫蒸餾水，在100 rpm轉(zhuǎn)速下制備成微乳，濾膜過濾后，取適量柚皮素微乳，滴至覆有碳膜的銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸(氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0)負(fù)染，自然揮干，用濾紙吸干銅網(wǎng)邊緣多余染液，于透射電鏡(TEM)下觀察微乳形態(tài)，結(jié)果見圖1(A)，微乳非連續(xù)相粒子呈球形乳滴，分布較為均勻。

2.5.2 柚皮素固體自微乳粒徑分布

取“2.5.1”項下所得微乳，過濾后用激光粒徑電位測定儀，粒徑分布圖見圖1(B)。由圖可知，柚皮素固體自微乳乳化后其粒徑為14.89 nm。

圖1 柚皮素固體自微乳透射電子顯微鏡及粒徑分布圖Fig.1 TEM and particle size distribution of naringenin solid self-microemulsifying

2.5.3 柚皮素固體自微乳流動性考察

2.5.3.1 休止角

將漏斗水平放置于平面上，取一定量待測物，在一定振動頻率下使柚皮素固體自微乳通過漏斗均勻流出，直至獲得最高的圓錐體，測量圓錐體斜面與平面的夾角，即得休止角，重復(fù)5次，取其平均值，由表2可以看出，休止角小于30°，其流動性較好。

2.5.3.2 卡式指數(shù)

取待測柚皮素固體自微乳，在一定振動強度下使待測物均勻由漏斗流入10 mL量筒中，精確稱重，計算松密度ρ0；采用輕敲法使其在量筒中處于最緊實狀態(tài)，計算振實密度ρf。通過公式C=(1-ρ0/ρf)×100%計算卡式指數(shù)，重復(fù)測定5次，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，卡式指數(shù)在15%～25%之間，表明其可壓性和填充性較好。

項目名稱Project name結(jié)果Results休止角Angle of rest28.6±1.3卡式指數(shù)Card index19.38±0.82

2.6 不對稱膜滲透泵膠囊殼的制備

本實驗采用浸入沉淀法進行濕法相轉(zhuǎn)移實現(xiàn)不對稱膜的制備，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，以醋酸纖維素為成膜材料，丙酮：無水乙醇(4∶1)為混合溶劑，甘油為致孔劑[10,11]。稱取處方量的醋酸纖維素、致孔劑，加入混合溶劑攪拌溶解混勻，配成囊殼聚合物膜材溶液，用栓模浸入上述溶液中，慢慢退出，再慢慢旋轉(zhuǎn)栓模，以確保聚合物膜材涂布均勻，再將栓模浸入10%的甘油溶液中，待浸入一定時間后，將栓模從甘油中取出，室溫下干燥、剝離、剪切得不對稱膜滲透泵膠囊殼囊帽和囊體[12]。

2.7 星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化不對稱膜滲透泵膠囊殼制備工藝

2.7.1 實驗設(shè)計[13]

根據(jù)前期預(yù)實驗和單因素實驗的考察，僅確定了影響不對稱膜滲透泵囊殼制備工藝的因素及范圍，其工藝需進一步優(yōu)化，本實驗選取醋酸纖維素濃度(X1)、栓模浸入聚合物溶液中時間(X2)、栓模浸入淬火液中時間(X3)為考察因素，用薄膜測厚儀測定不對稱膜滲透泵膠囊殼厚度，以藥物24 h累積釋放度(Y1)和不對稱膜滲透泵膠囊殼厚度(Y2)為評價指標(biāo)，采用星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化不對稱膜滲透泵膠囊殼的制備工藝，因素水平見表3，試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels

表4 實驗設(shè)計與結(jié)果 Table 4 Arrangement and results

續(xù)表4(Continued Tab.4)

序號No.X1(%)X2(min)X3(min)Y1(%)Y2(mm)1015416.581.480.5751110216.586.50.2751210616.581.550.26213104387.850.564141043092.520.64915～2010416.595.790.27

2.7.2 模型擬合

2.7.3 效應(yīng)面優(yōu)化

采用Design Expert 8.0軟件繪制不同影響因素對于響應(yīng)值的三維曲線，分別固定醋酸纖維素濃度、栓模浸入聚合物溶液中時間、栓模浸入淬火液中時間3個影響因素其中之一，考察其他2個因素對藥物累積釋放、不對稱膜滲透泵膠囊殼厚度的效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖2。根據(jù)方程和響應(yīng)面圖確定不對稱膜滲透泵膠囊殼最佳工藝是： 醋酸纖維素濃度為9.44%，栓模浸入聚合物溶液中時間3.77 min，栓模浸入淬火液中時間15.86 min。

圖2 藥物累積釋放度，膠囊殼厚度的效應(yīng)面的三維圖Fig.2 Response surface plot (3D) of cumulative drug release and capsule shell thickness

2.8 驗證試驗

根據(jù)優(yōu)化的最佳制備工藝：取80 mL丙酮與20 mL無水乙醇混合，作為混合溶劑；稱取10 g甘油置上述混合溶劑中攪拌溶解，再加入9.44 g醋酸纖維素，配成囊殼聚合物膜材溶液；用栓模浸入囊殼聚合物膜材溶液中3.77 min，慢慢退出，再慢慢旋轉(zhuǎn)栓模，以保證聚合物膜材涂布均勻，將栓模浸入10%甘油溶液中15.86 min，將栓模從甘油中取出，室溫下干燥，栓模上剝離，剪切得不對稱膜滲透泵膠囊殼囊帽和囊體；稱取柚皮素固體自微乳，按“2.9”項下的方法制備膠囊，測定其藥物累積釋放度與囊殼厚度，結(jié)果見表4。其中偏差=(預(yù)測值-實測值) / 預(yù)測值。通過驗證實驗可知，星點設(shè)計效應(yīng)面法所建立的模型預(yù)測性良好，方法可行，結(jié)果可靠，可較好地應(yīng)用于不對稱膜滲透泵膠囊殼制備工藝的優(yōu)化。

2.9 柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊的制備

取柚皮素固體自微乳適量，直接灌裝于不對稱膜滲透泵膠囊殼中，灌裝后在囊帽與囊體接口處涂上膠液，晾干，即得；膠囊內(nèi)容物總量為0.25 g，每粒膠囊含柚皮素152.5 mg。

表5 星點設(shè)計效應(yīng)面優(yōu)化法驗證Table 5 Verification of the central composite design-response surface methodology

2.10 裝量差異檢查

滲透泵膠囊理論裝量為0.25 g，混合好的柚皮素固體自微乳用膠囊板手工裝3批，每批取10粒，進行裝量差異檢查，測得平均裝量為0.253 8 g，上限為0.265 9 g(+4.8%)，下限為0.236 3 g(-6.9%)，符合《中國藥典》2015版相關(guān)規(guī)定，故采用1號膠囊，裝量為0.25 g。

2.11 體外釋藥行為的考察

2.11.1 轉(zhuǎn)速對藥物釋放的影響

按“2.1.3”項下釋放度測定法，分別測定制劑在轉(zhuǎn)速為50、100、150 rpm下24 h內(nèi)的釋放度，由圖3可顯示，不同轉(zhuǎn)速對藥物釋放基本無影響，可預(yù)測制劑在體內(nèi)釋放幾乎不受胃腸道蠕動影響。

圖3 不同轉(zhuǎn)速對釋放的影響Fig.3 Effect of rtation rate on drug release

2.11.2 不同釋放介質(zhì)對藥物釋放的影響

按“2.1.3”項下釋放度測定法，分別測定釋放介質(zhì)為0.1 mol/L鹽酸、pH4.5乙酸鹽緩沖液、pH6.8和pH8.6磷酸鹽緩沖液24 h內(nèi)的釋放行為。結(jié)果見圖4，由圖可知，在不同釋放介質(zhì)中藥物的釋放幾乎無差異，故釋放介質(zhì)的類型不影響釋藥行為。

2.12 釋藥模型擬合

采用Origin8.0分別對柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊體外釋藥曲線進行零級模型、一級模型、Higuchi模型擬合，結(jié)果見表6。

圖4 不同釋放介質(zhì)對釋放的影響Fig.4 Effect of media on drug release

模型Model擬合方程Fitting equationR零級模型Zero modelY=3.76t+2.580.999 7一級模型Level 1 modelY=-987 25(1-e0.000 039 6t)0.998 5Higuchi模型Higuchi modelY=24t1/2-320.985 8

由相關(guān)系數(shù)R可知，體外釋放模型擬合接近程度依次為：零級模型>一級模型>Higuchi模型，以零級釋藥方程擬合時，其R值最大且更接近1，結(jié)果表明柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊體外釋放符合零級釋藥模型，即柚皮素以恒速釋藥，達(dá)到了設(shè)計目的和要求。

2.13 自微乳滲透泵膠囊和柚皮素滲透泵膠囊體外釋放行為的比較

將柚皮素按照“2.9”項下方法制備柚皮素滲透泵膠囊，并按“2.1.3”項下方法進行體外釋放度考察，結(jié)果見圖5。由結(jié)果可知，柚皮素滲透泵膠囊在24 h內(nèi)累積釋放度僅為21.2%，而其自微乳滲透泵膠囊在同樣時間內(nèi)累積釋放度達(dá)90%以上。故有必要采用自微乳技術(shù)制備柚皮素滲透泵膠囊，從而提高藥物的溶解度。

圖5 柚皮素滲透泵膠囊與自微乳滲透 泵膠囊體外釋藥的比較(n=3) Fig.5 Comparison of naringenin release in vitro between osmotic pump capsules and microemulsion osmotic pump capsules (n=3)

3 結(jié)論

本實驗采用球晶造粒技術(shù)固化柚皮素自微乳，工藝簡單方便。在球晶造粒過程中使用了微粉硅膠，其主要作用是降低乳滴在固化過程中的粘性，且成球性較好。良溶劑和不良溶劑體系直接影響能否成球，本實驗中選擇的無水乙醇和液體石蠟作為溶劑系統(tǒng)，成球效果好，得率高。

本研究將自微乳與不對稱膜滲透泵膠囊相結(jié)合制得新型藥物傳遞系統(tǒng)，可雙重解決難溶性藥物柚皮素的水溶性和控釋制劑釋藥不完全的問題，顯著提高難溶性藥物的生物利用度。

以醋酸纖維素濃度、栓模浸入聚合物溶液中時間、栓模浸入淬火液中時間為考察因素，采用星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化不對稱膜滲透泵膠囊殼的制備工藝，其試驗次數(shù)少、精度高，充分考慮各因素之間的交互作用，運用非線性方程模型擬合，所建立的模型相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測性較好。

本實驗所制得的柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊，其釋藥曲線以不同模型進行擬合，通過擬合結(jié)果可知，零級模型R值最大且更接近1，說明柚皮素自微乳不對稱膜滲透泵膠囊達(dá)到了控釋制劑的設(shè)計要求。但其體內(nèi)外相關(guān)是否良好等需進一步深入研究。