連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

湯韻秋，全云云，余琳媛，鄭 立，李蕓霞

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

炎癥是臨床中最常見的病癥之一，是人體為了確保去除有害刺激并修復(fù)受損組織的一種防御反應(yīng)。據(jù)流行病學(xué)和臨床資料顯示，多數(shù)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都伴隨有炎癥反應(yīng)，炎癥還能加速疾病的發(fā)展[1]。此外炎癥反應(yīng)還可引起一些自身免疫疾病或癌癥，并且與許多慢性疾病如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、阿爾察默病、心血管疾病、癡呆、癌癥、肥胖及Ⅱ型糖尿病等密切相關(guān)[2]。因此，研究開發(fā)具有抗炎作用的藥物對(duì)于臨床開發(fā)意義重大。臨床證實(shí)，中國(guó)傳統(tǒng)中藥中具有抗炎作用的藥物眾多[3,4]，明確抗炎有效成分以及探索其抗炎作用機(jī)制已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。

中藥連翹為木犀科植物連翹(Forsythiasuspensa)的干燥果實(shí)，其性寒、味辛苦、無毒、入肺、心、膽經(jīng)具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效[5]，被喻為“瘡家圣藥”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床常用其治療急性呼吸道感染，皮膚化膿性感染、急性腎炎、肝炎、腦膜炎等病癥，以上病癥均與細(xì)菌、病毒引起的炎癥有關(guān)。關(guān)于連翹的抗炎作用成分研究一直是連翹研究的重點(diǎn)。連翹的主要化學(xué)成分多達(dá)150多種，主要包括木脂素類、苯乙醇苷類、五環(huán)三萜類和黃酮類等。對(duì)于連翹中的主要有效成分如連翹苷、連翹酯苷A等目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于它們的抗炎活性及作用機(jī)制[7-9]，而連翹中的另一活性成分往往被人們忽視，即連翹脂(phillygenin)。連翹脂素是連翹苷的苷元，屬于雙環(huán)氧木脂素[10]，是連翹中重要的木脂素類成分之一，被納為連翹的指紋成分。有研究表明連翹苷水溶性較差，口服吸收效果不理想[11]，在用人肝癌細(xì)(SMMC-7721) 進(jìn)行體外活性研究中，連翹苷沒有活性，連翹脂素具有活性[12]；在用小鼠黑色素肉瘤細(xì)胞B16對(duì)連翹脂素和連翹苷抗癌活性研究中，連翹苷沒有效果，而連翹脂素對(duì)小鼠黑色素肉瘤細(xì)胞B16有較強(qiáng)的抑制活性，甚至強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照的長(zhǎng)春新堿[13]。并且有實(shí)驗(yàn)通過大鼠腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化連翹苷發(fā)現(xiàn)連翹苷被迅速代謝為連翹脂素[14]。連翹脂素作為連翹苷的苷元也是連翹苷的代謝產(chǎn)物之一[15]，猜想連翹苷發(fā)揮抗炎藥效是否有連翹脂素的參與。已有研究表明連翹脂素具有較強(qiáng)的抗炎，抗氧化，降血脂活性[16,17]，但關(guān)于連翹脂素對(duì)炎癥因子影響及其機(jī)制方面的研究鮮見報(bào)道。

當(dāng)人體免疫細(xì)胞在受到致炎因子作用時(shí)，一些小分子量的、能在細(xì)胞間傳遞信息的、并且具有特異性免疫調(diào)節(jié)功能的可溶性蛋白質(zhì)或多肽通過機(jī)體本身分泌出來，并能參與或引起炎癥反應(yīng)，這些物質(zhì)被稱為炎癥因子，包括NO、TNF-α、IL-6、PGE2、IL-1等[18]。NO、IL-6、TNF-α都是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞活性因子，它們對(duì)細(xì)胞炎癥都有直接或間接的作用，彼此之間也產(chǎn)生影響。NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的主要介質(zhì)，氧化應(yīng)激能參與并加劇炎癥反應(yīng)[19]。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，具有抗炎和致炎的雙向功能，其作用與組織中的含量有關(guān)，正常水平的 IL-6對(duì)機(jī)體有利，產(chǎn)生過多會(huì)引起一系列炎性損傷[20]。TNF-α是一個(gè)經(jīng)典的炎癥指標(biāo)，具有對(duì)IL-1β、IL-6等的協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)作用，處于炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，其表達(dá)量的多少可以直接反映炎癥的嚴(yán)重程度[21]。iNOS是NO合成酶，它的表達(dá)直接決定NO分泌量，是炎癥反應(yīng)檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，調(diào)節(jié)NO的合成及其誘導(dǎo)型合成酶iNOS的表達(dá)被認(rèn)為是治療炎癥疾病的重要手段[22]。COX(環(huán)氧合酶)可以催化花生四烯酸生成前列腺素H2(PGH2)，而PGH2是前列腺素的前體。COX有三種類型的同工酶，其中COX-2與炎癥的關(guān)系最為密切。COX-2 在正常細(xì)胞中表達(dá)量很低，但是在被激活的巨噬細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞中表達(dá)水平會(huì)迅速上升，是一種反映炎癥嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志酶[26]。

因而為進(jìn)一步確定連翹脂素的抗炎作用及機(jī)制，本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為體外炎癥模型，觀察連翹脂素對(duì)炎癥因子NO、TNF-α、IL-6以及iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響，并以地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照，探討連翹脂素的抗炎作用及機(jī)制，以期為連翹脂素在臨床抗炎藥效的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)于上海元和生物有限公司。

1.2 試藥與試劑

連翹脂素(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)140722，≥ 98%)；脂多糖(美國(guó)sigma公司，批號(hào)20160926)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)18460504)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)SH40007.01)；胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)SH40003.01)；噻唑藍(lán)(MTT，Biosharp公司，批號(hào)M-2128)；青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)B150608)；鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號(hào)0171803202)；二甲基亞砜(DMSO，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為2015110201)；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2～7.4，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)150907)；硝酸還原酶法NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180530)；IL-6，TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司，批號(hào)201705，201705)；BCA蛋白試劑盒(聯(lián)科生物，批號(hào)A81911151)；引物(擎科生物公司合成)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(擎科生物，批號(hào)20180328)；iNOS、COX-2抗體(Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BS 124 S型分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TANKPE030型超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific公司)；AE2000型相差倒置顯微鏡(廈門Motic公司)；ALLEGER X-12型離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN Coulter公司)；varioskan flash-3001型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific公司)；QTOWER實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)ANALYTIKJENA公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，在含有抗生素(l00 U/mL青霉素、l00 U/mL鏈霉素)和10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的孵箱條件中培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)raw264.7細(xì)胞增殖率

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，以1×l05個(gè)/mL的密度將巨噬細(xì)胞懸濁液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)孔加入100 μL細(xì)胞懸濁液，放入孵箱培養(yǎng)24 h。小心吸去上清，加入含不同濃度的連翹脂素或地塞米松(0、1、5、10、25、50、100、150、200 μg/mL)的DMEM溶液，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)孔。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，操作過程避光。放入孵箱繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光輕微震蕩，待培養(yǎng)板內(nèi)結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率(細(xì)胞增殖率大于90%表明此濃度的藥物對(duì)細(xì)胞增值無明顯抑制作用)。

2.3 Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞懸濁液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，孵箱培養(yǎng)24 h，小心吸去上清?？瞻捉M加入DMEM溶液1 mL；LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液1 mL；LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液1 mL；陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50 μg/mL)地塞米松的DMEM溶液1 mL。放入細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照NO試劑盒操作，每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)孔，使用酶標(biāo)儀于550 nm處測(cè)定OD值并計(jì)算NO含量。

2.4 ELISA法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6釋放量

取對(duì)數(shù)期巨噬細(xì)胞RAW264.7，并調(diào)整濃度后，以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞懸濁液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，孵箱培養(yǎng)24 h，小心吸去上清。空白組加入DMEM溶液1 mL；LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液1 mL；LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液1 mL；陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50 μg/mL)地塞米松的DMEM溶液1 mL。放入細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作后，于450 nm處測(cè)定各OD值，根OD值，計(jì)算 TNF-α、IL-6細(xì)胞因子釋放水平。

2.5 Western blot 檢測(cè)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，小心吸取上清?？瞻捉M加入DMEM溶液3 mL；LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液3 mL；LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液3 mL；陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及地塞米松(50 μg/mL)的DMEM溶液3 mL，作用24 h后提取細(xì)胞總蛋白。將配制好的一抗(以抗體:5%BSA溶液1∶1 000稀釋)進(jìn)行免疫印跡，以GAPDH 作為內(nèi)參。顯影，并計(jì)算光密度值。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后，以每孔1 × 106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，小心吸取上清?？瞻捉M加入DMEM溶液3 mL；LPS組加入含LPS(10 ng/mL)的DMEM溶液3 mL；LPS+連翹脂素組加入含LPS(10 ng/mL)以及不同濃度(5、50、100 μg/mL)連翹脂素的DMEM溶液3 mL；陽(yáng)性對(duì)照組加入含LPS(10 ng/mL)以及地塞米松(50 μg/mL)的DMEM溶液3 mL。作用24 h后，吸棄上清液，用PBS清洗2次，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。按照擴(kuò)增試劑盒的程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以GAPDH做為內(nèi)參，分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

3 結(jié)果

3.1 連翹脂素及地塞米松對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

采用MTT 法考察細(xì)胞經(jīng)不同濃度連翹脂素及地塞米松處理后RAW264.7細(xì)胞增殖活性的變化。圖1(A)所示，與空白組比較，連翹脂素在給藥濃度為0～100 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。圖1(B)所示，地塞米松濃度在0～50 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取連翹脂素對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制的低、中、高濃度(5、50、100 μg/mL)開展研究，由于地塞米松100 μg/mL對(duì)細(xì)胞增殖有影響，于是選取5、50 μg/mL作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖1 連翹脂素及地塞米松對(duì)RAW264.7細(xì)胞增值的影響Fig.1 Effect of Phillygenin and dexamethasoneon proliferation of RAW264.7 cells

3.2 連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

圖2所示，LPS作用于RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞上清液中的NO分泌量明顯增加，與空白組比較，具有顯著性差異 (P<0.01) ，說明LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型建立成功。連翹脂素各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的NO含量明顯低于LPS組(P<0.05、P<0.01) ，并呈劑量依懶性。地塞米松各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的NO含量顯著低于LPS組(P<0.01)。5 μg/mL連翹脂素組NO含量高于5 μg/mL地塞米松組(P<0.01)。50 μg/mL連翹脂素組NO含量與50 μg/mL地塞米松組無顯著性差異。

圖2 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì) 胞NO釋放量的影響Fig.2 Effect of Phillygenine on content of NO in LPS induced RAW264.7cells注:與空白組比較##P<0.01；與 LPS 組比較 *P<0.05，**P<0.01.(下同)Note:Compare with control,##P<0.01;Compare with LPS, *P<0.05,**P<0.01.(The same below)

3.3 連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量的影響

LPS作用于RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-6含量明顯增加，與空白組比較，具有顯著性差異(P<0.01)。連翹脂素各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的TNF-α，IL-6含量顯著低于LPS組(P<0.01)，并呈劑量依懶性。地塞米松各質(zhì)量濃度細(xì)胞上清液中的TNF-α，IL-6含量顯著低于LPS組(P<0.01)。5 μg/mL連翹脂素組TNF-α，IL-6含量高于5 μg/mL地塞米松組(P<0.05)。50 μg/mL連翹脂素組TNF-α,IL-6含量與50 μg/mL地塞米松組無顯著性差異(見圖3)。

圖3 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α和IL-6釋放量的影響Fig.3 Effect of Phillygenine on content of TNF-α,IL-6 in LPS induced RAW264.7cells注：與同濃度地塞米松比較△P<0.05。Note:Compare with same contentration as dexamethasone △P<0.05.

3.4 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)下iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的

如圖4所示，未加任何刺激的空白組細(xì)胞中，iNOS、COX-2蛋白未見表達(dá)。與空白組比較，LPS 可以使iNOS、COX-2蛋白顯著表達(dá)，與 LPS 組比較，連翹脂素(5、50、100 μg/mL)呈濃度依賴性下調(diào)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)(P<0.05、P<0.01) ，尤其是連翹脂素高、中濃度組，對(duì)下調(diào)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)更為明顯(P<0.01)。說明連翹脂素通過下調(diào)激活RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)。由圖4(A)可見，與地塞米松相比，50 μg/mL連翹脂素與同濃度的地塞米松iNOS的蛋白表達(dá)量無明顯差異，表明連翹脂素有良好的抑制iNOS蛋白表達(dá)的作用。

圖4 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of Phillygenine on LPS-induced iNOS,COX-2 protein expression in RAW264.7 cells注:與同濃度地塞米松比較△△P<0.01， (下同)。Note:Compare with same contentration as dexamethasone △△P<0.01，the same below.

3.5 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)下iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，未加任何刺激的空白組細(xì)胞中，iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)量很少。與空白組比較，LPS可以使iNOS、COX-2 mRNA顯著表達(dá)，與 LPS 組比較，連翹脂素(5、50、100 μg/mL) 呈濃度依賴性下調(diào)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)(P<0.05、P<0.01) ，尤其是連翹脂素高、中濃度組，對(duì)下調(diào)iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)更為明顯(P<0.01)。由圖5(A)可見，與地塞米松相比，50 μg/mL連翹脂素與同濃度的地塞米松iNOS的mRNA表達(dá)量無明顯差異，表明連翹脂素有良好的抑制iNOS mRNA表達(dá)的作用。說明連翹脂素可以通過下調(diào)激活RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。

4 討論

本研究通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，探討連翹脂素的抗炎作用及其機(jī)制。在給藥濃度的確定上，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察連翹脂素各濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響，選取對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制(細(xì)胞增殖率大于90%)的低、中、高濃度(5、50、100 μg/mL)開展研究。陽(yáng)性藥地塞米松由于100 μg/mL對(duì)細(xì)胞增殖有影響(增殖率小于90%)，所以選取對(duì)細(xì)胞無明顯抑制且與連翹脂素相等的濃度(5、50 μg/mL)作為對(duì)照。以10 ng/mL的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，與空白組相比較發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)均顯著性增加，表明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥成功。

圖5 連翹脂素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Phillygenine on LPS-induced iNOS,COX-2 mRNA expression in RAW264.7 cells

本研究表明連翹脂素低、中、高濃度均可以抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO、TNF-α和 IL-6 表達(dá)上調(diào)，并呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系，說明連翹脂素的抗炎作用與抑制NO、TNF-α和 IL-6 釋放有關(guān)。以地塞米松作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性小于地塞米松，低濃度(5 μg/mL)連翹脂素抑制NO、IL-6、TNF-α的釋放能力弱于地塞米松，中濃度(50 μg/mL)連翹脂素抑制NO、IL-6、TNF-α的釋放能力與地塞米松無顯著性差異，提示連翹酯素具有較強(qiáng)的抗炎作用。分析原因，可能是由于地塞米松相較于連翹脂素對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性更大，當(dāng)給藥濃度為5 μg/mL時(shí)，由于濃度足夠低，毒性可以忽略，于是可以體現(xiàn)地塞米松良好的抗炎作用；而當(dāng)給藥濃度為50 μg/mL時(shí)，同樣的濃度，地塞米松對(duì)細(xì)胞的毒性較連翹脂素更大，更容易引起細(xì)胞分化，導(dǎo)致給藥效果不如連翹脂素。

在確定了連翹脂素具有良好的抗炎作用的基礎(chǔ)上進(jìn)行了對(duì)其抗炎機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，翹脂素低、中、高濃度均可以抑制它們的表達(dá)，并呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系，說明連翹脂素的抗炎機(jī)制與抑制iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。與地塞米松相比，50 μg/mL連翹脂素與同濃度地塞米松對(duì)iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)的抑制作用無顯著性差異，表明連翹脂素具有良好的抑制iNOS表達(dá)的藥理活性。

綜上所述，連翹脂素可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO、TNF-α和 IL-6 ，其作用機(jī)制與抑制iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。與地塞米松相比較，連翹脂素的抗炎效果良好，毒性較地塞米松更小，表明連翹脂素在抗炎活性方面具有巨大的開發(fā)潛力。