健骨注射液指紋圖譜及有效成分的傳遞

梁玉婷，王靜宇，蘇薇薇，幸林廣，姚宏亮，林橋輝，彭維

(1.中山大學(xué)廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275；2.廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530003)

健骨注射液是由壯藥特色藥戰(zhàn)骨制成的中藥單方制劑，具有活血散瘀，強(qiáng)筋健骨，驅(qū)風(fēng)止痛功效[1]，臨床上用于治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，急性腰扭傷，神經(jīng)根型頸椎病[2-4]。中藥制劑化學(xué)成分復(fù)雜，單一成分定量測(cè)定難以全面控制成品質(zhì)量。指紋圖譜具有“整體性”和“模糊性”特點(diǎn)，能系統(tǒng)反映中藥的整體特征，已被廣泛用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[5-6]，中藥注射劑標(biāo)準(zhǔn)提高和再評(píng)價(jià)工作也強(qiáng)調(diào)了指紋圖譜的重要性[7]。本研究首次采用高效液相色譜法對(duì)健骨注射液進(jìn)行指紋圖譜研究，通過比較原料藥材、中間體、成品指紋圖譜差別，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，并探討成品有效成分與原料藥材有效成分間的相關(guān)性，找出生產(chǎn)過程中的質(zhì)量傳遞規(guī)律，全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司，DGP-3600 SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機(jī)、WPS-3000 SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000 RS柱溫箱、DAD-3000檢測(cè)器、Chromeleon 7.2數(shù)據(jù)處理軟件)；Triple TOF 5600液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX 公司)；中藥粉碎機(jī)(YB-400A型，永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；十萬分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettlertoledo公司)；超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ250DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(Honeywell，QAFA1H，色譜級(jí))；冰乙酸(阿拉丁，E1519047，色譜級(jí))，甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，20170503-2，分析純)；甲酸為質(zhì)譜純；水為超純水。夏佛塔苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1119-201302，純度：w=92.5%)；維采寧-2(Sigma，批號(hào)：03980585，純度：w=94.28%)；維采寧-3(上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：4953，純度：w=98.7%)；陰性對(duì)照由廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。15 批次健骨注射液及對(duì)應(yīng)原料藥材、中間體的批號(hào)見表 1；另有一批次健骨注射液(批號(hào)：1608002，用于方法學(xué)驗(yàn)證)。

表1 15批次健骨注射液及對(duì)應(yīng)原料藥材、中間體Table 1 15 batches of Jiangu injection，raw herbs and intermediates

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 參照物溶液的制備 取夏佛塔苷、維采寧-2、維采寧-3對(duì)照品適量，精密稱定，加φ=20%乙腈，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz，溫度50 ℃)1 h使完全溶解，制成每1 mL含0.121 mg的夏佛塔苷、含0.166 mg的維采寧-2、含0.065 mg的維采寧-3混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取健骨注射液1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 中間體溶液的制備 精密量取0.1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 戰(zhàn)骨藥材溶液的制備 取戰(zhàn)骨飲片粉末(過三號(hào)篩)約1.5 g，精密加入φ=80%甲醇25 mL，稱量，靜置30 min，再超聲處理1 h，放冷，用φ=80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 陰性對(duì)照溶液的制備 取苯甲醇和聚山梨酯80各0.1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

Welch C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-φ=0.3%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脫(0～70 min:10%→20% A，90%→80% B)；柱溫：30 ℃；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，進(jìn)樣量為10 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》評(píng)價(jià)其相似度。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取健骨注射液、陰性對(duì)照、空白溶劑、中間體及戰(zhàn)骨藥材分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，結(jié)果各色譜峰均不受溶劑及輔料影響，表明專屬性良好(圖1)。

圖1 健骨注射液指紋圖譜專屬性試驗(yàn)Fig.1 HPLC fingerprint of specificity test for Jiangu injection(A：混合對(duì)照品；B：空白溶劑-φ=20%乙腈；C：陰性對(duì)照；D：健骨注射液；E：中間體；F：戰(zhàn)骨藥材；1：維采寧-2；3(S)：夏佛塔苷；4：維采寧-3)(A：Chromatogram of mixture of references；B：blank solvent-20% acetonitrile；C：negative control；D：Jiangu injection；E：intermediate；F：Premna fulva Craib；1：vicenin-2;3(S)；schaftoside；4：vicenin-3)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)1608002)，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其余6個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.07%，相對(duì)峰面積 RSD為0.13%～0.95%，相似度均>0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)1608002)，平行6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.04%～0.07%，相對(duì)峰面積 RSD為0.17%～1.26%，相似度均>0.98，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)1608002)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、3、6、9、12、24、48和72 h測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.03%～0.11%，相對(duì)峰面積 RSD為0.20%～1.94%，相似度均>0.96，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 耐用性試驗(yàn) 取同健骨注射液供試品溶液(批號(hào)1608002)，分別使用WelchUltimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hitachi LaChrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號(hào)的色譜柱，測(cè)定健骨注射液的指紋圖譜，記錄色譜圖，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.56%～2.42%，相對(duì)峰面積 RSD為0.12%～4.67%，相似度均>0.95，表明該方法耐用性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相關(guān)技術(shù)參數(shù)

2.4.1 指紋圖譜的建立 取10批健骨注射液、中間體、原料藥材按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》對(duì)10個(gè)批次指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)， 7個(gè)色譜峰為各批次所共有，因此確定這7個(gè)峰為共有峰；10批所測(cè)健骨注射液、中間體、原料藥材指紋圖譜的相似度均在0.92以上，見表2。

表2 10批健骨注射液、中間體、原料藥材指紋圖譜與共有模式的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarities of fingerprint for 10 batches of sample

2.4.2 成品與原料藥的相關(guān)性考察 通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》對(duì)10批成品、中間體、原料藥材指紋圖譜共有模式進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果其相似度均>0.98，表明成品、中間體、原料藥材相關(guān)性良好，健骨注射液生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，見圖2。

圖2 10批原料藥材、中間體、成品指紋圖譜共有模式圖(峰1：維采寧-2;峰3(S)：夏佛塔苷;峰4：維采寧-3)Fig.2 common model of HPLC fingerprints for 10 batches of sample(1：vicenin-2;3(S)：schaftoside;4：vicenin-3)

2.4.3 成品指紋圖譜檢測(cè) 另取11～15批健骨注射液按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，用上述10批健骨注射液所建立的共有模式為對(duì)照指紋圖譜，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》對(duì)5批新生產(chǎn)的健骨注射液進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度均>0.95。

2.5 共有特征峰的確證和指認(rèn)

2.5.1 對(duì)照品對(duì)照法 分別精密吸取混合對(duì)照品及成品供試品溶液，注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，采集色譜圖，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定位以及化學(xué)成分的 PDA光譜圖信息對(duì)比，確定1號(hào)峰、3號(hào)峰、4號(hào)峰分別為維采寧-2、夏佛塔苷、維采寧-3，結(jié)果見圖1。

2.5.2 UFLC-Triple-TOF-MS/MS成分鑒別 同參考文獻(xiàn)[8]。檢測(cè)結(jié)果通過質(zhì)譜中分子離子峰和碎片離子峰的相對(duì)分子質(zhì)量匹配、保留時(shí)間匹配等信息與參考文獻(xiàn)[8]對(duì)比，鑒定了健骨注射液指紋圖譜中其余4個(gè)色譜峰的化學(xué)成分，2號(hào)峰、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰分別為異夏佛塔苷[8]、Apigenin 6,8-di-C-arabinoside[8]、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷[8]、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷[8]，質(zhì)譜總離子流圖見圖3。

圖3 健骨注射液正模式(A)和負(fù)模式(B)總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of Jiangu injection in both positive(A) and negative(B) ion mode

表3 10批原料藥材、中間體、成品指紋圖譜共有模式的相似度評(píng)價(jià)Table 3 Similarities of fingerprint for 10 batches of sample

表4 5批健骨注射液指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 4 Similarities of fingerprint for 5 batches of Jiangu injection

2.6 原料藥材與成品有效成分傳遞分析

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.1”項(xiàng)下參照物溶液的制備。

2.6.2 樣品含量測(cè)定及轉(zhuǎn)移率 取10個(gè)不同批次的健骨注射液、中間體、原料藥材，按“2.1”項(xiàng)下制備方法進(jìn)行處理后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算維采寧-2、夏佛塔苷和維采寧-3的含量。再根據(jù)生產(chǎn)過程中藥材投料量與成品得率，計(jì)算10批原料藥材中這3種成分在健骨注射液中轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表5。

表5 總含量在戰(zhàn)骨藥材、中間體、注射液的相關(guān)性研究Table 5 Correlation study of total content in Premna fulva Craib, intermediate and Jiangu injection

接上表

No.有效成分戰(zhàn)骨藥材w/(mg·g-1)中間體w/(mg·g-1)藥材到中間體轉(zhuǎn)移率/%成品w/(mg·g-1)藥材到成品轉(zhuǎn)移率/%08夏佛塔苷1.260.311-0.184-維采寧-21.450.420-0.477-維采寧-31.060.210-0.219-總計(jì)3.770.94124.960.88023.3409夏佛塔苷1.320.243-0.216-維采寧-21.240.331-0.296-維采寧-30.8510.170-0.138-總計(jì)3.410.74421.810.65019.0610夏佛塔苷0.7340.241-0.240-維采寧-20.6040.299-0.307-維采寧-30.3840.126-0.123-總計(jì)1.720.66638.680.67038.91藥材平均總含量/(mg·g-1)5.54平均轉(zhuǎn)移率/%29.09平均轉(zhuǎn)移率/%26.43SD/%3.07SD/%5.21SD/%5.96藥材平均總含量±SD/(mg·g-1)2.47～8.61平均轉(zhuǎn)移率±SD/%23.88～34.30平均轉(zhuǎn)移率±SD/%20.47～32.39

3 討 論

本研究首次建立了健骨注射液指紋圖譜，戰(zhàn)骨藥材、中間體、健骨注射液具有良好相關(guān)性，說明產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜可以全面監(jiān)控原料藥材、中間體和成品的質(zhì)量。

本研究在構(gòu)建指紋圖譜的基礎(chǔ)上，同時(shí)檢測(cè)了健骨注射液中3種有效成分，考察它們?cè)谒幉?、中間體、成品中的含量變化情況，并探討了生產(chǎn)過程中有效成分的質(zhì)量傳遞規(guī)律。結(jié)果表明：從藥材到中間體的提取，對(duì)健骨注射液有效成分的含量影響較大；在生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的情況下，投料藥材的質(zhì)量與成品的質(zhì)量呈正相關(guān)，依據(jù)注射液中每克生藥中有效成分的含量(mg)=藥材中每克生藥中有效成分的含量(mg)×轉(zhuǎn)移率(%)，可通過藥材成分含量推測(cè)成品有效成分含量。

中藥的有效成分從原料藥材到中間體的傳遞規(guī)律，反映了中藥生產(chǎn)中的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，如提取溶劑的選擇，提取時(shí)間及溫度的設(shè)定等參數(shù)，對(duì)于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中藥產(chǎn)品具有積極意義。本研究揭示了有效成分從戰(zhàn)骨藥材到成品的傳遞規(guī)律，為健骨注射液的投料藥材、生產(chǎn)過程及質(zhì)量控制提供了指導(dǎo)，同時(shí)也為其他中藥提供了參考。