豬流行性腹瀉IgA、IgG抗體與PEDV抗原相關(guān)性研究

朱海俠 王玉玲 潘海城 曾亮明 傅星源 潘小慧李梟辰 俞建萍 范 凱 黃澤敏 翁燕梅 饒?jiān)破?/p>

（福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性消化道疾病。主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，腹瀉仔豬死亡率高達(dá)100%[1]。PEDV是一種腸嗜性病毒，主要經(jīng)消化道進(jìn)入小腸感染機(jī)體。一旦被PEDV感染，PEDV在感染機(jī)體的腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)大量增殖，被感染的細(xì)胞迅速溶解壞死，導(dǎo)致明顯的小腸絨毛萎縮，吸收表面積減少，小腸黏膜堿性磷酸酶含量顯著減少，進(jìn)而引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，導(dǎo)致腹瀉、脫水、死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)PEDV的感染與仔豬日齡緊密相關(guān)，低日齡仔豬的感染和發(fā)病情況更為嚴(yán)重，14日齡以下仔豬感染PEDV后，其死亡率為90%，而14～28日齡仔豬的死亡率會(huì)下降至40%，提高低日齡仔豬對(duì)PEDV的抵抗力是保護(hù)仔豬的關(guān)鍵[3-4]。疫苗免疫母豬后，誘導(dǎo)乳汁免疫，隨后通過(guò)其初乳和乳汁傳遞至新生仔豬，以實(shí)現(xiàn)對(duì)新生仔豬的早期被動(dòng)免疫。低日齡仔豬腸道細(xì)胞再生較慢，或者初生仔豬各免疫系統(tǒng)還不夠完善可能是導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)病率更為嚴(yán)重的原因[5]。而具備相對(duì)完善免疫系統(tǒng)的成年豬和育肥豬，病毒感染增殖的同時(shí)，腸內(nèi)的多種免疫細(xì)胞針對(duì)各自特定靶細(xì)胞受體作出應(yīng)激反應(yīng)，阻止了豬流行性腹瀉病毒繼續(xù)感染機(jī)體。腸道組織中的局部黏膜免疫系統(tǒng)在對(duì)抗PEDV感染的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6-7]。

盡管IgG抗體占初乳免疫球蛋白總量的60%以上，但I(xiàn)gA抗體對(duì)于中和腸道感染的病原體比IgG抗體更有效果[8]。母源抗體中的IgG免疫球蛋白被仔豬腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)提供體液免疫，而IgA免疫球蛋白則粘附在腸道上。哺乳仔豬通過(guò)吮吸母乳獲得母源抗體SIgA后，SIgA能夠抑制PEDV在腸道上皮細(xì)胞的附著與增殖，保護(hù)仔豬腸道上皮細(xì)胞，阻止PEDV侵入機(jī)體[9]。研究表明，接受母源抗體的仔豬、保育豬糞樣中PEDV的RNA載量明顯減少，母豬乳汁IgA抗體水平高，其所產(chǎn)仔豬糞樣中PEDV的RNA載量相對(duì)就低[10]?？讏@園等[11]研究發(fā)現(xiàn)，母豬乳汁中IgA抗體水平高，仔豬發(fā)病率就會(huì)降低，反之發(fā)病率會(huì)增加。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PEDV IgA、IgG抗體間接ELISA方法以及PEDV RT-PCR病原學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)免疫母豬群和疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進(jìn)行相關(guān)抗體水平及PEDV測(cè)定，探討IgA、IgG抗體水平與PEDV病原之間的相關(guān)性，以期為我國(guó)豬群豬流行性腹瀉免疫效果評(píng)估及程序的制定、優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 乳汁采自廣東地區(qū)某豬場(chǎng)疑似仔豬腹瀉母豬群乳汁及免疫過(guò)豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗相關(guān)產(chǎn)品的豬群乳汁、血清。

1.2 主要試劑 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit購(gòu)自金瑞鴻捷（廈門(mén)）生物科技有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker 和dNTPs（2.5 mmol/L）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技 （北京）有限公司；PEDV乳汁IgA、IgG抗體檢測(cè)試劑盒為實(shí)驗(yàn)室自建。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中登陸的PEDV ORF3基因序列，通過(guò)Primer Permier 5.0和Oligo 7.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列及樣品處理方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.2 PEDV RT-PCR的擴(kuò)增 以處理好的樣品cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的能夠區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的特異性引物對(duì)疑似仔豬腹瀉母豬群14份乳汁進(jìn)行常規(guī)的PEDV RT-PCR檢測(cè)，確定乳汁中PEDV的感染情況。擴(kuò)增體系20 uL：其中2×Max 10 μL、上下游引物（20 μmol/mL）各 0.4 μL、cDNA 0.4 μL、 補(bǔ)充去離子水至終體積為 20 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 2 min，98℃變性 10 s；58℃退火5 s，72℃延伸5 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測(cè)方法的建立采用純化的PEDV抗原包被ELISA微量反應(yīng)板，按照常規(guī)間接ELISA操作方法[13-14]，建立PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測(cè)方法。采用PEDV抗體ELISA檢測(cè)方法對(duì)上述送檢的疑似仔豬腹瀉豬場(chǎng)14份乳汁進(jìn)行IgA抗體水平測(cè)定，并對(duì)免疫豬群乳汁對(duì)應(yīng)的血清樣品進(jìn)行IgA、IgG抗體水平測(cè)定，確定乳汁中PEDV IgA抗體與血清中IgA、IgG抗體水平及其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV RT-PCR擴(kuò)增 采用特異性檢測(cè)引物對(duì)疑似仔豬腹瀉豬群的14份乳汁進(jìn)行常規(guī)PEDV RT-PCR檢測(cè)，確定14份乳汁中有6份為PEDV陽(yáng)性 （確定7號(hào)樣品為PEDV疫苗株，其片段大小為278 bp，其余5份均為PEDV野毒感染，其片段大小為327 bp），且腹瀉豬只中PEDV野毒陽(yáng)性率為100%（見(jiàn)表 1、圖 1）。

表1 樣品中PEDV抗原檢測(cè)結(jié)果

2.2 乳汁IgA抗體水平的測(cè)定 采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PEDV IgA抗體檢測(cè)方法對(duì)送檢的14份乳汁樣品進(jìn)行IgA抗體水平檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14份乳汁中有4份IgA抗體呈現(xiàn)陰性，其中標(biāo)記為腹瀉豬只的IgA抗體陰性率占100%。且在陽(yáng)性樣品中，當(dāng)乳汁中IgA抗體水平接近臨界值（0.3）時(shí)，乳汁中PEDV基本呈現(xiàn)陽(yáng)性（見(jiàn)表2）。

圖1 乳汁樣品中PEDV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 乳汁IgA抗體水平測(cè)定

2.3 PEDV IgA、IgG抗體水平的測(cè)定 采用實(shí)驗(yàn)室自建的PEDV IgA、IgG抗體檢測(cè)方法對(duì)送檢免疫健康豬群乳汁及其相對(duì)應(yīng)的血清樣品進(jìn)行IgA、IgG抗體水平檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA、IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關(guān)（見(jiàn)圖2-圖4），同時(shí)對(duì)乳汁和血清中IgA抗體水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)血清中IgA抗體遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳汁中的抗體水平（見(jiàn)圖 3）。

圖2 乳汁中IgA、IgG抗體水平測(cè)定圖

3 討 論

研究表明，種豬胎盤(pán)屏障結(jié)構(gòu)決定了母源抗體不能直接通過(guò)胎盤(pán)直接傳遞給仔豬，因此，仔豬獲得母源抗體的主要途徑是通過(guò)初乳的攝入。初乳中富含IgG抗體，仔豬攝入后迅速進(jìn)入血液循環(huán)形成保護(hù)性抗體，攝入的IgA抗體可以在腸道局部黏膜建立黏膜免疫，共同抵御外界病原微生物的入侵[15]。對(duì)疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進(jìn)行PEDV病原學(xué)檢測(cè)及IgA抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有腹瀉仔豬對(duì)應(yīng)的母豬乳汁中PEDV抗原均呈現(xiàn)陽(yáng)性，而腹瀉仔豬所吮乳汁中IgA抗體呈陰性，且乳汁中IgA抗體水平趨于臨界值的情況下，乳汁中PEDV亦呈現(xiàn)陽(yáng)性。說(shuō)明乳汁中IgA抗體水平可以反映出哺乳仔豬的黏膜免疫情況[16]。此外，乳汁中的IgA抗體只有達(dá)到一定的水平才能對(duì)仔豬腸道黏膜具有保護(hù)作用，低水平的IgA抗體很容易受到PEDV的攻擊。通過(guò)檢測(cè)乳汁中IgA抗體水平的高低，可以直接對(duì)疫苗免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而分析仔豬的免疫保護(hù)力情況，及時(shí)做好PED的免疫防控工作。

圖3 血清與乳汁中IgA抗體水平測(cè)定圖

圖4 血清中IgA、IgG抗體水平測(cè)定圖

對(duì)免疫豬群乳汁IgA抗體及其對(duì)應(yīng)的血清IgA、IgG抗體進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA和IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性，這與先前報(bào)道的結(jié)果一致[17]。研究表明，母豬口服感染PEDV的腸道內(nèi)容物，利用熒光中和試驗(yàn)測(cè)定母豬和哺乳仔豬的血清、母豬初乳和乳汁中中和抗體滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEDV感染后3周內(nèi)母豬血清樣品中可檢測(cè)到中和抗體，且乳汁中和抗體滴度至少與母豬血清樣品中一樣，而初乳樣品中的抗體滴度均高于血清和血清樣品。表明初乳和乳汁是仔豬中和抗體的來(lái)源[18]。對(duì)免疫豬群乳汁和血清中IgA、IgG抗體進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，結(jié)果提示，通過(guò)血清中IgG的抗體水平能夠間接反映出母豬乳汁中IgA的抗體水平情況，解決了早期因乳汁黏度過(guò)大、難以采集的問(wèn)題，大大提高了樣品采集的效率，降低了豬只的應(yīng)激反應(yīng)，及時(shí)、有效地為我國(guó)豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。此外，乳汁中的IgA抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清中的IgA，再次佐證PEDV黏膜免疫機(jī)理：PEDV到達(dá)PP結(jié)后，致敏的B細(xì)胞可歸巢至乳腺，在乳腺局部分泌二聚體IgA，以SIgA形式存在于乳汁中。單體IgA可以進(jìn)入血液循環(huán)，SIgA難以進(jìn)入血液，而是錨定在黏膜表面形成保護(hù)層，抵御病原侵入。

由豬流行性腹瀉病毒引起的豬流行性腹瀉在全國(guó)范圍內(nèi)暴發(fā)，且該病在臨床中具有一定的隱蔽性，因此，探尋一個(gè)有效的免疫評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。為進(jìn)一步探討乳汁中IgA抗體水平與PEDV易感程度的相關(guān)性，本研究對(duì)健康場(chǎng)豬群乳汁IgA抗體水平及PEDV抗原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳汁IgA抗體陽(yáng)性值接近臨界值時(shí)，PEDV抗原檢測(cè)為陰性，而在發(fā)病場(chǎng)豬群乳汁中則可以檢測(cè)到PEDV抗原。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在存在PEDV感染的條件下，高水平的IgA抗體能夠有效地抵御PEDV入侵。母源SIgA的水平與仔豬對(duì)PEDV感染的抵抗力有關(guān)，而血液中的中和抗體與其對(duì)仔豬的保護(hù)作用沒(méi)有相關(guān)性[19-20]。因此，如何有效地刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的高水平IgA抗體，是防控豬流行性腹瀉的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

乳汁IgA抗體是有效保護(hù)低日齡仔豬早期免于PEDV感染的關(guān)鍵性抗體，其抗體水平較低的情況下，極易受到PEDV入侵，該抗體水平變化與疫病的進(jìn)程和機(jī)體的抗病毒能力具有一定的相關(guān)性。此外，通過(guò)血清中IgG抗體水平的檢測(cè)能夠間接反映出疫苗的免疫保護(hù)水平，有效解決了初乳難以采集的問(wèn)題，能夠及時(shí)有效地為我國(guó)豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及其優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。