NCAPH、AXL和YAP在喉癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

黃永陽(yáng) 張超 周延輝

河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科（河南洛陽(yáng)471000）

非染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白凝縮蛋白復(fù)合體Ⅰ亞單位 H（Non-SMC condensinⅠcomplex subunit H，NCAPH）是多蛋白組成的蛋白復(fù)合體，屬于Barr家族成員，在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中對(duì)染色體的組裝和染色體的分離發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)染色體的分離及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性［1］。AXL屬于受體酪氨酸激酶家族，參與細(xì)胞黏附、促增殖、抗凋亡及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等各種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程［2］。Yes結(jié)合蛋白（YAP）是Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄共激活因子，在器官生長(zhǎng)、組織再生、細(xì)胞增殖等中具有關(guān)鍵調(diào)控作用［3-4］。研究［5-7］顯示，NCAPH、AXL和YAP與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達(dá)及與喉癌預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究著眼于初步了解NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達(dá)，探討NCAPH、AXL和YAP的表達(dá)與喉癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，研究聯(lián)合檢測(cè)NCAPH、AXL和YAP在預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)、評(píng)估遠(yuǎn)期生存中的指導(dǎo)意義，以期明確聯(lián)合檢測(cè)NCAPH、AXL和YAP可以作為一組新的喉癌預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的客觀指標(biāo)。

1 資料及方法

1.1一般資料收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院景華院區(qū)2012年10月至2013年6月喉癌患者術(shù)后組織蠟塊標(biāo)本40例作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)期聲帶息肉患者術(shù)后組織蠟塊標(biāo)本40例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前活檢及術(shù)后病理均提示喉鱗狀細(xì)胞癌；（2）均為首發(fā)病例，術(shù)前均未行任何喉癌相關(guān)治療；（3）未患有其他惡性腫瘤和影響本研究結(jié)果的其他疾?。唬?）所有喉癌患者術(shù)后均依照當(dāng)時(shí)最新美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）標(biāo)準(zhǔn)給予正規(guī)的化療、放療；（5）臨床病例資料及術(shù)后隨訪資料完整可靠。本研究中所有納入對(duì)象都是男性，在收集病例標(biāo)本時(shí)有2名女性罹患喉癌，但因不符合本實(shí)驗(yàn)納入標(biāo)準(zhǔn)而被排除在外。所收集喉癌患者年齡32～87歲，平均59.78歲，中位年齡58.5歲。40例喉癌按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版TNM分期為Ⅰ期18例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例；高分化25例，中分化11例，低分化4例；聲門上型10例，聲門型26例，聲門下型4例。

1.2主要試劑即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物，NCAPH多克隆抗體（克隆號(hào)Ag2076，1∶100稀釋）、YAP多克隆抗體（克隆號(hào)Ag4510，1∶100稀釋）均購(gòu)于武漢三鷹生物有限公司，AXL多克隆抗體（克隆號(hào)558，1∶100稀釋）購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化步驟石蠟切片烤片、脫蠟、水化，自來(lái)水沖洗、蒸餾水浸泡，檸檬酸鹽高壓修復(fù)，PBS沖洗，3%H2O2室溫孵育阻斷過(guò)氧化物酶，滴加5%BSA室溫孵育進(jìn)行封閉，滴加一抗4℃過(guò)夜，室溫放置30 min PBS沖洗，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定喉癌組織中NCAPH陽(yáng)性表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，AXL陽(yáng)性表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，YAP陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞漿和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。100×光鏡下挑選腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)域，200×光鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性=0，弱陽(yáng)性=1，中等陽(yáng)性=2，強(qiáng)陽(yáng)性=3。陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)分級(jí)為：≤10%（陰性 =0），11% ～30%（弱陽(yáng)性 =1），31% ～50%（中等陽(yáng)性=2），＞50%（強(qiáng)陽(yáng)性 =3）。當(dāng)兩者得分之和≥3時(shí)判定為高表達(dá)，得分＜3時(shí)判定為低表達(dá)［8］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，蛋白表達(dá)和喉癌臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)、Fisher′s精確檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線，并用Log rank test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NCAPH、AXL和YAP在喉癌和聲帶息肉組織中的表達(dá)本研究中NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的高表達(dá)率明顯高于聲帶息肉組織（圖1～3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表1。

2.2喉癌組織中AXL、YAP和NCAPH在不同臨床病理參數(shù)中的表達(dá)本研究40例喉癌組織中AXL、YAP和NCAPH的表達(dá)與臨床病理參數(shù)中的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度有關(guān)（P＜0.05），在年齡、解剖分區(qū)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2。

2.3AXL、YAP和NCAPH蛋白在喉癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析本研究40例喉癌組織中，AXL與YAP在喉癌中兩者共高表達(dá)者18例，共低表達(dá)者10例，卡方檢驗(yàn)分析，χ2=5.736，P=0.017（P ＜0.05），說(shuō)明喉癌組織中AXL與YAP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用spearman法行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.379，P=0.016（P＜ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達(dá)有相關(guān)性，呈正相關(guān)。

圖1 NCAPH在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達(dá)（SP，200×）Fig.1 Expression of NCAPH in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

圖2 AXL在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達(dá)（SP，200×）Fig.2 Expression of AXL in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

圖3 YAP在喉癌組織及聲帶息肉組織中的表達(dá)（SP，200×）Fig.3 Expression of YAP in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

表1 NCAPH、AXL和YAP在喉癌及聲帶息肉組織中的表達(dá)之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of NCAPH，AXL and YAP in laryngeal carcinoma and vocal cord polyps 例

表2 喉癌組織中AXL、YAP、NCAPH蛋白表達(dá)與臨床因素之間的關(guān)系（Fisher's精確檢驗(yàn)）Tab.2 Relationship between AXL，YAP and NCAPH protein expression and clinical factors in laryngeal carcinoma tissues（Fisher′s exact test） 例

本研究40例喉癌組織中，AXL與NCAPH在喉癌中兩者共高表達(dá)者12例，共低表達(dá)者12例，卡方檢驗(yàn)分析，χ2=2.072，P=0.151（P＞ 0.05），說(shuō)明喉癌組織中AXL與NCAPH的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用spearman法行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.228，P=0.158（P＞ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達(dá)相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究40例喉癌組織中，YAP與NCAPH在喉癌中兩者共高表達(dá)者12例，共低表達(dá)者10例，卡方檢驗(yàn)分析，χ2=0.825，P=0.364（P＞ 0.05），說(shuō)明喉癌組織中YAP與NCAPH的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用spearman法行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.144，P=0.377（P＞ 0.05），提示兩者在喉癌中的表達(dá)相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 AXL、YAP和NCAPH在喉癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系本研究40例喉癌患者，5年隨訪仍存活31例，死亡7例，失訪2例，5年生存率77.5%。本研究將總生存時(shí)間作為患者預(yù)后狀況的評(píng)估指標(biāo)?？偵鏁r(shí)間事件包括所有原因所導(dǎo)致的患者死亡，但本研究中所納入病例患者均因喉癌及其并發(fā)癥導(dǎo)致死亡，未出現(xiàn)患者因其他原因死亡的情況。

23例AXL高表達(dá)的喉癌患者中，存活15例、死亡6例、失訪2例，17例AXL低表達(dá)的喉癌患者中存活16例，死亡1例，用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，χ2=2.782，Plog-rank=0.095（P＞ 0.05），提示AXL的高表達(dá)與喉癌患者的生存狀況的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

25例YAP高表達(dá)的喉癌患者中，存活17例、死亡7例、失訪1例，15例YAP低表達(dá)的喉癌患者中存活14例，失訪1例，用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，χ2=4.806，Plog-rank=0.028（P＜ 0.05），提示YAP的高表達(dá)與喉癌患者的生存狀況的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明YAP的表達(dá)與喉癌患者的預(yù)后有相關(guān)性。

17例NCAPH高表達(dá)的喉癌患者中，存活9例、死亡6例、失訪2例，23例NCAPH低表達(dá)的喉癌患者中存活22例，死亡1例，用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，χ2=6.761，Plog-rank=0.009（P＜ 0.05），提示NCAPH的高表達(dá)與喉癌患者的生存狀況的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NCAPH的表達(dá)與喉癌患者的預(yù)后有相關(guān)性。

2.540例喉癌患者預(yù)后因素的COX模型分析調(diào)用COX回歸過(guò)程，擬合COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型，分別分析NCAPH、AXL、YAP的表達(dá)情況對(duì)40例喉癌患者生存期的影響。篩選后的模型，只有NCAPH一個(gè)協(xié)變量，提示NCAPH的表達(dá)對(duì)患者的生存期有影響（χ2=8.680，P=0.002＜0.05）。擬合COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型P=0.018＜0.05，說(shuō)明NCAPH在喉癌中的表達(dá)強(qiáng)度為影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，相對(duì)危險(xiǎn)度HR=0.078，說(shuō)明NCAPH高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)為NCAPH低表達(dá)患者的0.078倍，HR的可信區(qū)間（95%CI）為0.009～0.651。

3 討論

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，約占每年新發(fā)腫瘤的2.4%，常見的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，約占95%以上［9］。盡管治療方法不斷改進(jìn)，喉癌的發(fā)病率仍有增多趨勢(shì)，復(fù)發(fā)亦較常見，嚴(yán)重危害人類健康。目前還沒有特異性的指標(biāo)用于喉鱗狀細(xì)胞癌的診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。在分子水平上對(duì)喉癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及預(yù)后關(guān)系的研究，有助于喉癌診治水平的提高，加強(qiáng)患者預(yù)后的評(píng)估，提高患者的術(shù)后生存質(zhì)量，已成為近幾年的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，分子與基因標(biāo)志物在惡性腫瘤的診斷、侵襲與預(yù)后的預(yù)測(cè)等方面的應(yīng)用日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)許多分子標(biāo)志物包括腫瘤相關(guān)抗原、細(xì)胞黏附與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的分子、腫瘤血管生成相關(guān)的分子等與喉癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲性具有相關(guān)性，某些蛋白的表達(dá)改變可以預(yù)測(cè)喉癌的預(yù)后。

本研究顯示，NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的高表達(dá)率明顯高于喉良性病變組織，提示NCAPH、AXL和YAP可能參與喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究顯示NCAPH、AXL和YAP在喉癌組織中的表達(dá)與喉癌的臨床分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、組織分化程度有關(guān)，與年齡、解剖分區(qū)無(wú)相關(guān)性。提示NCAPH、AXL和YAP可能參與了喉癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究顯示AXL與YAP在喉癌組織中的表達(dá)存在正相關(guān)，提示AXL與YAP在喉癌組織中的表達(dá)可能存在正性調(diào)控作用。本研究顯示NCAPH和YAP在喉癌中的表達(dá)強(qiáng)度與喉癌的預(yù)后相關(guān)，NCAPH和YAP高表達(dá)提示較差的臨床預(yù)后。這與其他實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果3種目標(biāo)蛋白在癌組織中的高表達(dá)率高于良性病變組織及正常組織一致［10-14］。隨訪研究顯示，本研究40例喉癌患者，5年生存率77.5%。這與國(guó)內(nèi)外關(guān)于喉癌生存率的報(bào)道基本一致［15］。

本研究顯示AXL的表達(dá)與喉癌患者的預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍不能否認(rèn)AXL與喉癌的臨床預(yù)后有關(guān)。本研究通過(guò)COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示NCAPH在喉癌中的表達(dá)強(qiáng)度為影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，相對(duì)危險(xiǎn)度HR=0.078，提示NCAPH高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)為NCAPH低表達(dá)患者的0.078倍。HR的計(jì)算不僅考慮了終點(diǎn)事件的有無(wú)，還考慮了到達(dá)終點(diǎn)所用的時(shí)間及截尾的數(shù)據(jù)。本研究得出的HR值較小及AXL的表達(dá)與喉癌患者的預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮有幾方面的影響：（1）本次研究的隨訪時(shí)間較短，而喉癌的5年生存率較高，研究中獲得的隨訪數(shù)據(jù)存在一定程度的誤差；（2）本次實(shí)驗(yàn)研究樣本量較少，需要更大的樣本量來(lái)證實(shí)以及獲取更加準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù)。

NCAPH、AXL和YAP參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的機(jī)制暫未明確。有研究顯示，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）致癌蛋白E7可以通過(guò)E2F1上調(diào)NCAPH的mRNA及蛋白水平，E2F1可作為轉(zhuǎn)錄因子作用于NCAPH的啟動(dòng)子區(qū)，從而激活NCAPH的表達(dá)［5］，而HPV感染是目前研究最為廣泛的喉部鱗狀細(xì)胞癌感染性因素［16-18］。研究還顯示，敲低NCAPH可以明顯抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，NCAPH可能是通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）機(jī)制來(lái)影響癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力［5］。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞獲取間質(zhì)特點(diǎn)并失去上皮特性，導(dǎo)致細(xì)胞的黏附能力降低，從而使細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［19-21］。有研究認(rèn)為，癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的AXL能夠?qū)е禄|(zhì)金屬蛋白酶MMP-9基因的表達(dá)，造成基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的分解，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究提示AXL是EMT的下游效應(yīng)器，能使細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。YAP是Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄共激活因子。Hippo信號(hào)通路調(diào)控抵抗失巢凋亡、促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、EMT等各種生化過(guò)程的分子機(jī)制是當(dāng)前腫瘤生物學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)［22-24］。這提示3種目標(biāo)蛋白在喉癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度均與EMT機(jī)制有關(guān)聯(lián)，NCAPH、AXL和YAP可能是通過(guò)多種途徑聯(lián)合作用參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

綜上所述，本研究通過(guò)檢測(cè)喉癌組織和喉良性病變組織中AXL、YAP和NCAPH的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AXL、YAP和NCAPH與喉癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系，提示NCAPH、AXL和YAP在評(píng)估喉癌患者遠(yuǎn)期生存中具有重要的指導(dǎo)意義。而3種目標(biāo)蛋白在喉癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度均與EMT機(jī)制有關(guān)聯(lián)，3種目標(biāo)蛋白在喉癌組織中的表達(dá)和分子作用機(jī)制可能都有一定的關(guān)聯(lián)性。本研究樣本量較少，實(shí)驗(yàn)方法較為單一，且隨訪時(shí)間短，所得結(jié)論需要進(jìn)一步研究證實(shí)。經(jīng)過(guò)擴(kuò)大樣本量、利用多種實(shí)驗(yàn)方法以及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步研究，明確其作用機(jī)制，聯(lián)合檢測(cè)AXL、YAP和NCAPH有望作為一組新的喉癌預(yù)后判斷的客觀指標(biāo)，甚至有望成為喉癌臨床分子治療的有效靶點(diǎn)。