柴枳半夏湯加減對(duì)結(jié)核性胸膜炎治療前后胸膜厚度及炎癥因子的影響

潘靜潔 黃晉 劉堂營(yíng)

廣州市胸科醫(yī)院中醫(yī)科（廣州510095）

結(jié)核性胸膜炎（tuberculous pleuritis）屬于肺外結(jié)核病，是結(jié)核桿菌及其自溶產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物首次侵入機(jī)體的胸腔膜所引起的胸膜炎癥，2000年已經(jīng)被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新分類法歸納為結(jié)核病的第四類型［1-2］。一般在臨床上，結(jié)核性胸膜炎容易導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而促使血管通透性增高，隨后發(fā)生纖維化、漿液滲出增加進(jìn)而引起胸水，然后胸腔積液會(huì)在不同的細(xì)胞因子刺激下，進(jìn)一步引發(fā)肺纖維化，最終嚴(yán)重影響肺組織的正常功能，引起胸膜炎的臨床癥狀［2-4］?！督饏T要略·痰飲咳嗽病脈證并治》：“飲后水流在脅下，咳唾引痛，謂之懸飲。”證見(jiàn)脅下脹滿，咳嗽或唾涎時(shí)兩脅引痛，甚則轉(zhuǎn)身及呼吸均牽引作痛，心下痞硬脹滿，或兼干嘔、短氣，頭痛目眩，或胸背掣痛不得息，因此在中醫(yī)的理論劃分中，結(jié)核性胸膜炎屬于“懸飲”范疇［5］。而柴枳半夏湯出自《醫(yī)學(xué)入門》，能和解少陽(yáng)，清熱宣肺，柴胡、黃芩和解少陽(yáng)，瓜蔞、半夏、枳殼寬胸祛痰利氣，青皮、赤芍理氣止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，對(duì)懸飲初期出現(xiàn)的胸脅悶痛等具有良好的臨床療效，其中柴胡、枳殼、桔梗也被廣泛認(rèn)為具有良好的抗纖維作用［6-7］。柴枳半夏湯還能調(diào)暢中焦氣機(jī)，《難經(jīng)·二十二難》曰：“氣主呴之，血主濡之”。氣行則血行，治血先治氣。而近年來(lái)，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，胸腔積液中有許多成分，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）與胸膜厚度和炎癥反應(yīng)的變化具有密切關(guān)系［7-9］，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）則是纖維化過(guò)程中非常關(guān)鍵的細(xì)胞因子［10］。因此，基于我院科室利用柴枳半夏湯加減聯(lián)合抗結(jié)核藥及胸腔穿刺引流術(shù)治療結(jié)核性胸膜炎取得良好療效的臨床基礎(chǔ)上，觀察治療前后胸膜厚度、胸腔積液消失時(shí)間以及采用RT-PCR檢測(cè)胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的變化，以期揭示柴枳半夏湯加減治療結(jié)核性胸膜炎的作用機(jī)制，為柴枳半夏湯的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年3月1日至2019年2月28日在我科住院接受診治的結(jié)核性胸膜炎病人80例，按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為聯(lián)合組和對(duì)照組，每組40例。本研究中所有患者均已簽署我院的知情同意書，患者本人及其家屬均對(duì)研究的方法和臨床意義知情并且同意配合開(kāi)展，且本研究已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意。其中聯(lián)合組中男22例，女18例，平均年齡為（54.6±19.1）歲，病程（25.4±5.2）d，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（22.9±2.2）kg/m2，而對(duì)照組中男 19例，女21例，平均年齡為（50.3±18.5）歲，病程（29.3±7.5）d，BMI為（23.2±2.8）kg/m2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，兩組患者在性別比、BMI、病程長(zhǎng)短和年齡等一般資料相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），資料具有可比性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2017版《WS288-2017肺結(jié)核診斷》中對(duì)于結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)制定。（1）臨床診斷：PPD試驗(yàn)呈現(xiàn)陽(yáng)性者（硬結(jié)平均直徑≥10 mm）；IGRAS檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果；結(jié)核抗體陽(yáng)性者；影像所見(jiàn)為滲出性胸腔積液，表現(xiàn)為少量或中大量的游離積液，或存在于胸腔任何部位的局限積液，胸水常規(guī)、生化表現(xiàn)為滲出液。（2）確診病例：涂片顯微鏡檢查陽(yáng)性；分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性；胸腔積液或胸膜病理學(xué)檢查表現(xiàn)為上皮細(xì)胞樣肉芽腫性炎，顯微鏡下可見(jiàn)壞死性和非壞死性肉芽腫，PCR檢測(cè)陽(yáng)性。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞75歲或＜18歲的患者；（2）其他疾病原因引起胸腔積液的患者；（3）近期曾進(jìn)行抗結(jié)核治療的患者；（4）合并嚴(yán)重臟器功能衰竭不宜服用中藥的患者；（5）主客觀不配合治療的患者；（6）未簽署知情同意書的患者。

1.4治療方法對(duì)照組：入院后常規(guī)胸部彩色多普勒超聲檢查及胸腔積液定位，鹽酸利多卡因（國(guó)藥準(zhǔn)字H37022839，山東華魯制藥有限公司）局部浸潤(rùn)麻醉，胸腔穿刺引出胸水進(jìn)行檢查，首日引出量≤600 mL，以后每日引出量≤1 000 mL，直至胸水完全吸收。確診結(jié)核性胸膜炎后，給予常規(guī)抗結(jié)核方案2HRZE/4HR治療，對(duì)年輕患者在急性期加用醋酸潑尼松片30 mg/次（國(guó)藥準(zhǔn)字H44020682，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司），1次/d，逐漸減量，療程8周，對(duì)有浸潤(rùn)性結(jié)核灶、有糖尿病史者和老年人暫緩使用。強(qiáng)化期2～3個(gè)月，總療程6個(gè)月以上。

聯(lián)合組：在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上給予柴枳半夏湯治療，每日1劑，水煎至400 mL，早晚兩次分服，療程8周，柴枳半夏湯加減：柴胡12 g，黃芩12 g，四花青皮10 g，枳殼10 g，姜水半夏10 g，桔梗10 g，瓜蔞皮15 g，赤芍10 g，桑根白皮10 g，甘草5 g，加減：咳嗽劇烈、肋痛加白芥子10 g，干嘔腹脹加黃連5 g，持續(xù)高熱加麻杏石甘湯（本研究所用到的中藥飲片均采購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司）。

1.5療效評(píng)價(jià)（1）按照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中《懸飲》療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，治愈：臨床癥狀消失，胸水吸收，實(shí)驗(yàn)檢查正常。好轉(zhuǎn)：癥狀好轉(zhuǎn)，胸水減少。未愈：癥狀、胸水均未改善。（2）采用B超測(cè)量胸膜厚度及判斷胸腔積液消失時(shí)間，記錄治療前后的胸膜厚度（取3個(gè)不同的部位測(cè)量然后取平均值），胸腔積液消失時(shí)間為初次檢查時(shí)間至復(fù)查未見(jiàn)積液時(shí)間。（3）記錄治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的變化，RT-PCR檢測(cè)：取胸水5 mL，加入適量Trizol試劑，根據(jù)說(shuō)明書提取總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒從等量的RNA獲得cDNA，然后再使用ABI 7500和SYBR Premix ExTaqⅡ進(jìn)行RT-qPCR。β-actin作為mRNA的定量對(duì)照。引物序列如下：TGF-β1 sense：5′-GTGGAAAGCGGCAACCAA-3′，TGF-β1 antisense：5′-GCCCGAGAGAGCAATACAGG-3′；TNF-α sense：5′-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGA-3′，TNF-α antisense：5′-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3′；IFN-γ sense：5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3′，IFN-γ antisense：5′-TTCGACTGATTAATAAGC-3′；β -actin sense：5′-TTCCTGGGCATGGAGTCCT-3′；β-actin antiense：5′-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間以及治療前后的比較采用兩獨(dú)立樣本配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料（臨床療效）的比較采用Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同組患者臨床療效比較按照療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組中治愈的患者有20例，而好轉(zhuǎn)的患者有16例，其臨床有效率（90.0%）明顯高于對(duì)照組（67.5%），經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后顯示兩組患者臨床療效組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同組患者臨床療效對(duì)比Tab.1 Comparison of clinical efficacy of different groups of patients 例

2.2不同組患者胸腔積液消失時(shí)間以及治療前后胸膜厚度變化經(jīng)過(guò)治療后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組患者胸腔積液消失時(shí)間為（16.84±2.97）d，明顯長(zhǎng)于聯(lián)合組（12.57±3.10）d，其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，兩組患者治療前胸膜厚度的差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是，治療8周后聯(lián)合組患者胸膜厚度小于對(duì)照組，其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3不同組患者治療前后TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的變化為了進(jìn)一步探究柴枳半夏湯加減治療結(jié)核性胸膜炎的作用機(jī)制，本研究通過(guò)RTT-PCR檢測(cè)兩組患者治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，治療前，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平并差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但經(jīng)過(guò)8周的治療后，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平均發(fā)生了顯著下調(diào)，治療前后的表達(dá)水平下調(diào)倍數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；另外，與對(duì)照組相比，聯(lián)合組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平下調(diào)更為顯著，其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

表2 不同組患者胸腔積液消失時(shí)間以及治療前后胸膜厚度變化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

表2 不同組患者胸腔積液消失時(shí)間以及治療前后胸膜厚度變化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

注：與治療前相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，#P＜0.05

組別 胸腔積液消失時(shí)間（d）胸膜厚度（mm）治療前 治療8周對(duì)照組聯(lián)合組16.84±2.97 12.57±3.10#5.2±0.67 5.1±0.58 3.9±0.61*3.3±0.46*#

3 討論

結(jié)核分枝桿菌及其自溶產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物引起的結(jié)核性胸膜炎是一種常見(jiàn)的內(nèi)科疾病，隨著現(xiàn)代生活水平的提高，這種疾病的患者數(shù)量也越來(lái)越多［3，11］。目前，大部分結(jié)核性胸膜炎是急性病，主要表現(xiàn)為結(jié)核分支桿菌的全身中毒癥狀以及胸腔積液導(dǎo)致的局部癥狀。結(jié)核分支桿菌的全身中毒癥狀為發(fā)熱、畏寒、出汗、乏力、食欲不振等；胸腔內(nèi)積液可以刺激胸膜，從而導(dǎo)致反射性干咳，當(dāng)體位轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)癥狀會(huì)更加明顯，而當(dāng)積液量少時(shí)僅有胸悶、氣促等癥狀，一旦胸腔內(nèi)存在大量積液，則會(huì)壓迫肺、心和縱隔，出現(xiàn)呼吸困難［12］。目前，對(duì)胸腔積液的患者，一般都會(huì)采用胸膜腔穿刺術(shù)來(lái)抽取積液達(dá)到治療效果，然后再結(jié)合抗結(jié)核方案對(duì)結(jié)核性胸膜炎進(jìn)行治療。大量研究［11，13-14］表明，引起結(jié)核性胸膜炎的途徑主要有：（1）肺門淋巴結(jié)核的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過(guò)淋巴管逆流到胸膜；（2）結(jié)核桿菌或其代謝產(chǎn)物直接進(jìn)入到胸膜腔內(nèi)；（3）急性血行播散性結(jié)核導(dǎo)致胸膜炎；（4）胸椎結(jié)核或肋骨結(jié)核向胸膜腔發(fā)生潰破導(dǎo)致胸膜炎等。現(xiàn)有的胸腔鏡活檢已經(jīng)證實(shí)了大部分結(jié)核性胸膜炎壁層胸膜有明顯的結(jié)核病理改變，因此，結(jié)核性胸膜炎的主要發(fā)病機(jī)制是結(jié)核分枝桿菌直接遍及胸膜而導(dǎo)致的［12，15］。劉凌等［16］通過(guò)觀察比較結(jié)核性胸膜炎患者胸水和血清中INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的含量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌及其自溶產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物進(jìn)入胸膜腔時(shí)，主要會(huì)引起細(xì)胞的免疫應(yīng)答，刺激CD4+淋巴細(xì)胞活化增殖，分化為Th1和Th2細(xì)胞［17］，Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要是INF-γ、IL-2等，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞直接殺死結(jié)核桿菌，結(jié)核病患者的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫通常減弱，而傾向激活Th2細(xì)胞，Th2分泌的多種細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等也一定程度上可以抑制Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，減少Th1型細(xì)胞因子生成，降低巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的能力，從而削弱了保護(hù)性免疫應(yīng)答，這種Th1/Th2細(xì)胞的比例失調(diào)，容易導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性感染，或形成空洞，排菌等［18-20］。另外，處于增殖周期的單核-巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞還會(huì)釋放大量的IL-2、TNF-α和IFN-γ，導(dǎo)致結(jié)核性胸膜炎患者胸水中細(xì)胞因子的活性增強(qiáng)［21］。還有研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IFN-γ與胸膜厚度、炎癥反應(yīng)的變化密切相關(guān)，可見(jiàn)在結(jié)核性胸膜炎的臨床評(píng)價(jià)中，TNF-α和IFN-γ的含量變化可以直接反映藥物的療效。近年來(lái)，新的CD4+淋巴細(xì)胞亞型，Th3細(xì)胞被關(guān)注，Th3可能從Th0細(xì)胞分化而來(lái)，Th3細(xì)胞能調(diào)節(jié)并抑制免疫細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞因子的分泌，Th3細(xì)胞能分泌TGF-β1，而TGF-β1也能誘導(dǎo)產(chǎn)生Th3，Th3細(xì)胞比例與TGF-β1表達(dá)水平呈正相關(guān)［22-23］。已有研究［24-26］證實(shí)，TGF-β1可以通過(guò)Smads依賴性信號(hào)通路、非Smads依賴性信號(hào)通路，以及其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)通路參與到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)錄、胸膜血管新生等過(guò)程中。因此，本研究將TGF-β1、TNF-α和IFN-γ，以及胸膜厚度、胸腔積液消失時(shí)間作為主要的觀察指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)藥物的臨床療效。

圖1 兩組患者治療前后胸水中TGF-β1（A）、TNF-α（B）和IFN-γ（C）mRNA的表達(dá)水平Fig.1 The mRNA expression level of TGF-β1（A），TNF-α（B）and IFN-γ（C）in pleural effusion before and after treatment in two groups

目前，已有報(bào)道中藥湯劑能使降低患者胸水及血清TGF-β1水平，減少胸水產(chǎn)生，降低胸膜增厚粘連發(fā)生率［6-7，27］。張偉等［28］通過(guò)觀察活血化瘀法聯(lián)合常規(guī)治療對(duì)結(jié)核性胸膜炎患者胸膜厚度和纖維蛋白原（FIB）的含量變化，發(fā)現(xiàn)活血化瘀類中藥能夠有效降低胸膜的厚度，抑制患者胸水中纖維蛋白原的表達(dá)，從而改善疾病的預(yù)后情況［29］?！恫耔装胂臏烦鲎浴夺t(yī)學(xué)入門》，能和解少陽(yáng)，清熱宣肺，柴胡、黃芩和解少陽(yáng)，瓜蔞、半夏、枳殼寬胸祛痰利氣，青皮、赤芍理氣止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，對(duì)懸飲初期出現(xiàn)的胸脅悶痛等具有良好的臨床療效。其中柴胡、枳殼、桔梗也被廣泛認(rèn)為具有良好的抗纖維作用［6，30-31］。因此，基于我科在臨床上應(yīng)用柴枳半夏湯加減結(jié)合抗結(jié)核藥及胸腔穿刺引流術(shù)治療結(jié)核性胸膜炎取得良好療效的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR檢測(cè)兩組患者治療前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平的變化以及胸膜厚度、胸腔積液消失時(shí)間等，對(duì)兩組患者治療前后臨床療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者治療后，聯(lián)合組的臨床有效率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組患者胸腔積液消失時(shí)間明顯長(zhǎng)于聯(lián)合組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組患者胸膜厚度明顯小于對(duì)照組（P＜0.05），表明柴枳半夏湯加減結(jié)合抗結(jié)核藥及胸腔穿刺引流術(shù)能夠有效縮短胸腔積液消失的時(shí)間和減輕患者胸膜增厚的程度。為了進(jìn)一步探究柴枳半夏湯治療結(jié)核性胸膜炎的作用機(jī)制，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療后，兩組患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的水平發(fā)生明顯下調(diào)，治療前后的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且組間比較，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明柴枳半夏湯加減結(jié)合抗結(jié)核藥及胸腔穿刺引流術(shù)很可能是通過(guò)抑制TGF-β1、TNF-α和IFN-γ的基因表達(dá)，從而激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌，并抑制肺組織纖維化的過(guò)程，減輕結(jié)核性胸膜炎患者胸膜的增厚程度和加快胸腔積液的消失，最終發(fā)揮治療作用。

綜上所述，柴枳半夏湯加減結(jié)合胸腔穿刺加常規(guī)抗結(jié)核治療，比單純胸腔穿刺加抗結(jié)核治療對(duì)結(jié)核性胸膜炎更加有效，可能是與聯(lián)合治療方法能夠抑制TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕胸膜增厚有關(guān)。另外，柴枳半夏湯加減還能夠調(diào)節(jié)機(jī)體氣機(jī)，降低TGF-β1的表達(dá)水平，從而抑制纖維化的程度和纖維蛋白的表達(dá)，從而改善結(jié)核性胸膜炎患者的臨床癥狀，提高療效。然而，目前針對(duì)中醫(yī)藥方劑結(jié)合西藥治療結(jié)核性胸膜炎的研究不多，因此，后續(xù)需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究中醫(yī)藥結(jié)合西藥治療懸飲其他辨證分型的療效，并深入探討中西醫(yī)結(jié)合治療結(jié)核性胸膜炎的信號(hào)通路和作用機(jī)制，以期提供更加完善的科學(xué)依據(jù)，為臨床上應(yīng)用柴枳半夏湯治療結(jié)核性胸膜炎奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。