革蘭氏染色法觀察與區(qū)分細菌

譚 嘯 章熙東

(1 河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室 南京 210098； 2 江蘇省南京外國語學(xué)校 南京 210008)

問題來源于生產(chǎn)與生活，知識運用于探索與實踐，基于真實情境下的生物學(xué)教學(xué)能讓學(xué)生接觸實際問題，了解真實現(xiàn)象，有效提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。在高中生物學(xué)教材中，細菌作為原核生物的代表被重點提及，作為影響人類健康的一些病原體也被學(xué)生所認知。于是在“利用顯微鏡觀察細胞”的實驗課中，學(xué)生觀察了諸如“草履蟲、黑藻、口腔上皮”等常見細胞后，有學(xué)生提出： 能否觀察細菌細胞，了解它們的真面目？因此，筆者推薦開展“革蘭氏染色法觀察與區(qū)分細菌”的實驗教學(xué)。

革蘭氏染色法是丹麥醫(yī)生C. Gram在1884年最先發(fā)明的。幾年后，德國病理學(xué)家C. Weighert改進并加入了番紅復(fù)染的步驟[1]。如今，革蘭氏染色法成為常見的微生物鑒別方法，細菌個體微小、結(jié)構(gòu)簡單，通常呈透明狀態(tài)，未經(jīng)染色的細菌在光學(xué)顯微鏡下難以觀察和區(qū)分。經(jīng)革蘭氏染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察細菌的形態(tài)、細胞排列方式及某些結(jié)構(gòu)特征，還可以用于細菌分類鑒定。

1 染色原理

革蘭氏染色法的原理解釋主要有三種： 等電點學(xué)說、化學(xué)學(xué)說、滲透學(xué)說。

等電點學(xué)說關(guān)注不同細菌的等電點差異，細菌的等電點在pH為2～5，在中性環(huán)境中，菌體帶負電，很容易與堿性染料結(jié)合(如結(jié)晶紫、甲基紫、以及教材經(jīng)常提及的龍膽紫)，并且陽性菌的等電點(2～3)通常比陰性菌(4～5)低，媒染的碘液為弱氧化劑，可以降低陽性菌的等電點，使兩者等電點差異擴大。因而，初染的結(jié)晶紫與陽性菌的結(jié)合力比陰性菌強，不易被乙醇洗脫[2]。

化學(xué)學(xué)說關(guān)注革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有的核糖核酸鎂鹽-蛋白復(fù)合物。在初染和媒染后，核糖核酸鎂鹽-蛋白復(fù)合物、結(jié)晶紫、碘液三者在陽性菌細胞內(nèi)結(jié)合，此結(jié)合物不易被乙醇洗脫。所以，陽性菌呈紫色。而陰性菌細胞內(nèi)缺乏核糖核酸鎂鹽，碘與結(jié)晶紫的胞內(nèi)攝入量少，并且不能牢固結(jié)合，易被乙醇洗脫。

滲透學(xué)說關(guān)注細菌細胞壁成分與結(jié)構(gòu)。革蘭氏陽性菌細胞壁厚(約20～80 nm)，結(jié)構(gòu)較簡單，主要含肽聚糖和磷壁酸；革蘭氏陰性菌細胞壁薄(約10 nm)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分外壁層和內(nèi)壁層，外壁層又分三層： 最外層是脂多糖，中間是磷脂層，內(nèi)層是脂蛋白。內(nèi)壁含肽聚糖(含量低，結(jié)構(gòu)松散)，不含磷壁酸。細菌在結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了碘與結(jié)晶紫的復(fù)合物，陽性菌由于細胞壁較厚、脂類含量低，肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)致密，因而在乙醇脫色時，細胞因失水使網(wǎng)孔收縮，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物滯留在壁內(nèi)，細胞呈紫色。而陰性菌細胞壁薄且類脂含量高、肽聚糖含量低且交聯(lián)松散。在乙醇脫色時，含脂層迅速溶解，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物很容易從薄而松散的結(jié)構(gòu)中洗脫，再經(jīng)紅色染料復(fù)染后，陰性菌就呈紅色。

20世紀(jì)60年代，Salton曾提出細菌細胞壁在革蘭氏染色中的重要作用[3]。1983年，Beveridge等[4]用鉑代替媒染劑碘液，再用電子顯微鏡觀察到結(jié)晶紫與鉑復(fù)合物可被陽性菌的細胞壁阻留，進一步證明了由于細胞壁化學(xué)成分的差異而引起染色反應(yīng)的不同，滲透學(xué)說具有較強的說服力[5]。

2 實驗步驟與注意事項

革蘭氏染色需要用到的試劑及配制過程如下[1]： ①結(jié)晶紫試劑： 結(jié)晶紫2 g，草酸銨0.8 g， 95%乙醇20 mL，蒸餾水80 mL。先將結(jié)晶紫溶于乙醇，草酸銨溶于蒸餾水，然后將兩個溶液混勻置于密閉的棕色瓶，靜置48 h后使用。②碘液： 碘化鉀2 g，碘1 g，蒸餾水100 mL。為使碘充分溶解，應(yīng)先溶解碘化鉀，再將碘溶于碘化鉀溶液。③番紅試劑： 番紅2.5 g，溶于100 mL 95%乙醇，取10 mL番紅乙醇溶液溶于80 mL蒸餾水，搖勻。

革蘭氏染色的各步驟中，脫色是最重要且最難把握的步驟。各步驟注意事項如表1。

3 “三步法”革蘭氏染色

上世紀(jì)末，出現(xiàn)了“三步法”革蘭氏染色。黃元桐等[8]把酒精脫色與復(fù)染的兩步合并，減少操作步驟、縮短時間、提高了效率。后來，洪慶華等[9]用0.4%堿性品紅乙醇溶液作為復(fù)染劑，可以達到脫色和復(fù)染雙重效果，結(jié)果準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好。在教學(xué)中，為方便學(xué)生操作，提高實驗效率，可以引入“三步法”的革蘭氏染色。

4 常見問題與分析

以下是革蘭氏染色實驗教學(xué)中常見的問題和原因分析：

表1 革蘭氏染色的注意事項

(1) 剛接種的細菌細胞濃度低且一些生理特征未完全表現(xiàn)，老齡的革蘭氏陽性菌由于衰亡或自溶導(dǎo)致細胞壁通透性改變而出現(xiàn)假陰性，應(yīng)在細菌的對數(shù)生長期進行染色。

(2) 涂片不宜過厚，以免脫色不充分，造成假陽性。

(3) 成敗的關(guān)鍵步驟是乙醇脫色。如果脫色過度，陽性菌可被誤認為陰性菌；如果脫色不足，陰性菌會被誤認為陽性菌。

(4) 染色過程中切勿使載玻片上的染色液干涸，否則會形成染色液結(jié)晶顆粒，影響觀察。

(5) 用水沖洗后，應(yīng)輕輕吸去殘水，避免復(fù)染液被稀釋而影響效果。

(6) 陽性菌的等電點比陰性菌低，在相同pH條件下進行染色，陽性菌細胞會吸附更多的堿性染料，不易脫去，而陰性菌則相反。所以，不能忽視染色時pH的影響。例如，在堿性條件，兩類菌吸附的堿性染料都多，可能都呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；在酸性條件，可能都呈陰性反應(yīng)。

(7) 如果對未知菌的染色結(jié)果沒把握，可在同一塊載玻片上涂上與未知菌形態(tài)差異較大的已知細菌作為對照(如： 枯草芽孢桿菌或大腸桿菌)，這樣可以判斷染色結(jié)果的正確性和可靠性。

5 常見的革蘭氏陽性菌與陰性菌

革蘭氏染色法不僅可以鑒別真細菌，還可以用于鑒別古菌、真菌、藍細菌等。所有的放線菌和真菌，有芽孢的桿菌和大多數(shù)球菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridiumtetani)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)等都呈革蘭氏陽性反應(yīng)。藍細菌、弧菌、螺旋體、多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)革蘭氏陰性反應(yīng)，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、痢疾桿菌(ShigellaCastellani)、傷寒桿菌(Salmonellaenterica)、變形桿菌(Proteusspecies)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)等。致病菌僅僅作為知識內(nèi)容進行了解，在教學(xué)實驗操作中應(yīng)避免涉及致病菌，在對環(huán)境樣品的分析中也要加強安全防護。