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    探討新型隱球菌腦膜炎不同檢測方法的診斷價值

    2019-07-31 08:06:54黃賽林阮子強向璇
    實驗與檢驗醫(yī)學 2019年4期
    關鍵詞:墨汁膠體金腦膜炎

    黃賽林,阮子強,向璇

    (廣東三九腦科醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

    新型隱球菌腦膜炎(CNM)是由新型隱球菌感染腦膜和(或)腦實質(zhì)所致[1],屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞急性或慢性炎癥性疾病。常見首發(fā)癥狀以頭痛、頭暈、嘔吐和發(fā)熱為主,由于其顱內(nèi)感染時癥狀的不典型性及治療的不規(guī)范,誤診率及病死率仍較高[2]。近年來隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛或不適當應用,免疫缺陷性疾病及器官移植患者的增加,該病呈增長趨勢[3]。在流行病學上,新型隱球菌屬于一種機會性感染真菌,病原體多從呼吸道吸入,形成肺部病灶后經(jīng)血液循環(huán)播散于腦膜。據(jù)文獻報道,隱球菌性腦膜炎發(fā)生率和死亡率在發(fā)達國家達到10%~30%,在發(fā)展中國家可達到50%~100%[3]。因此,臨床早期快速準確地診斷對于隱球菌腦膜炎的鑒別和診斷很有必要。目前墨汁染色對新型隱球菌的實驗診斷依然為一種有效的經(jīng)典診斷方法,但需較多標本量離心處理后收集沉淀,制片墨汁負染后進行鏡檢,因而標本處理繁瑣、耗時,且結果判斷主觀性較大。真菌培養(yǎng)法為新型隱球菌檢測的基本方法,但敏感性低,耗時較長。上世紀80年開始乳膠凝集方法檢測血清和腦脊液中新型隱球菌莢膜多糖的定性或半定量的方法,但操作步驟繁瑣,結果判定主觀性也較大[4]。膠體金方法是繼乳膠凝集方法后建立的檢測新型隱球菌的方法,IMMY公司于2009年研發(fā)了膠體金方法試劑盒,其在常溫下性狀穩(wěn)定,技術要求低,操作簡單,檢測時間短,結果易判讀。國內(nèi)臨床檢測和流行病學研究多使用乳膠凝集方法進行檢測,而近年來采用膠體金方法進行檢測新型隱球菌感染診斷逐漸得到推廣[5]。為了客觀評價目前新型隱球菌檢測方法在臨床檢測中的應用價值,并探索降低假陽性的方法,本研究以墨汁染色、隱球菌培養(yǎng)、膠體金方法進行敏感度和特異性比較,并分析新型隱球菌診斷方法在腦膜炎鑒別診斷中的作用。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象 根據(jù)病史、臨床癥狀、體征、實驗室檢查和病原學檢查(墨汁涂片或培養(yǎng)陽性)以及抗生素和抗結核藥物治療無效,改用抗真菌藥物治療有效,確診為隱球菌性腦膜炎47例(其中21例經(jīng)腦脊液真菌培養(yǎng),39例經(jīng)墨汁染色確診的隱球菌性腦膜炎,其余8例是病例跟蹤及后期臨床動態(tài)觀察確診)(診斷標準依據(jù)2010年中國真菌學雜志發(fā)表的《中國隱球菌診治專家共識》)。病例來自于2016年1月至2017年12月廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)科住院患者,其中男34例,女13例,年齡20~70歲。所有腦脊液標本均為第一次腰穿留取均在抗真菌藥物使用之前。對照組共60例(其中腦脊液常規(guī)生化正常非神經(jīng)系統(tǒng)感染20例、經(jīng)臨床確診為結核性腦膜炎的腦脊液20例、及化膿性腦膜炎為細菌感染且無真菌感染20例。

    1.2 儀器和試劑 隱球菌抗原檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)為美國IMMY有限公司產(chǎn)品;印度墨汁染液由貝索公司提供。隱球菌真菌肉湯為廣州市迪景微生物科技有限公司生產(chǎn)。

    1.3 檢測方法

    1.3.1 隱球菌抗原膠體金法 依據(jù)試劑產(chǎn)品說明書,試管中加入1滴樣本稀釋液,腦脊液經(jīng)過離心(3000r/min)10min后取上清40μl加入試管, 插入試紙條,10min后讀取結果。出現(xiàn)一條質(zhì)控線為陰性,質(zhì)控線與檢測線同時出現(xiàn)為陽性,只出現(xiàn)檢測線而無質(zhì)控線則檢測失敗。

    1.3.2 隱球菌墨汁染色鏡檢 根據(jù)墨汁染色標準操作,墨汁染液選用印度墨汁,將3ml以上的腦脊液離心(3000r/min)10min,沉渣以 5:1 比例與墨汁混勻鏡檢,在黑色背景下可見到透亮的菌體和寬厚莢膜。

    1.3.3 隱球菌培養(yǎng)和鑒定 依據(jù)第四版 《全國臨床檢驗操作規(guī)程》,培養(yǎng)腦脊液3~5ml接種到真菌肉湯,陽性標本接種沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)2~5d分純后進行菌種的鑒定。

    1.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。

    2 結果

    2.1 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養(yǎng)試驗的靈敏度及特異性 47例最終被確診的隱球菌腦膜炎中,隱球菌膠體金法靈敏度100%,特異性98.33%;墨汁染色靈敏度65.95%,特異性98.33%;隱球菌培養(yǎng)靈敏度63.63%,特異性100%。

    2.2 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養(yǎng)試驗在隱球菌組和對照組中的檢測結果 在隱球菌組中,隱球菌膠體金法陽性47例、墨汁染色陽性31例、隱球菌培養(yǎng)21例(其中共33例培養(yǎng),陽性21例結果均為新型隱球菌);對照組中除化膿性腦膜炎腦脊液中,隱球菌膠體金法陽性1例、墨汁染色陽性1例,隱球菌膠體金法、墨汁染色、隱球菌培養(yǎng)其余均無陽性結果。見表1。

    表1 膠體金法、墨汁染色和培養(yǎng)試驗在各組中的檢測結果

    3 討論

    新型隱球菌腦膜炎的患者,典型表現(xiàn)為重度的頭痛;頭痛可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月,伴有精神狀態(tài)、性格的改變,發(fā)熱,嗜睡和昏迷。多數(shù)資料顯示隱球菌感染和使用廣譜抗生素、激素、免疫抑制藥的廣泛或不適當有關,以及免疫缺陷性疾病及器官移植患者的幾率高[6],但是我院首發(fā)癥狀按頭痛在神經(jīng)內(nèi)科就診患者病史中禽鳥類接觸者占多,特別是鴿子飼養(yǎng)者,隱球菌主要在鴿糞和被鴿糞污染的土壤中大量存在[7],并無其他系統(tǒng)疾病引發(fā),但是因為數(shù)據(jù)有限,無法進行流行學統(tǒng)計。臨床癥狀與結核性腦膜炎不易鑒別,易誤診為結核性腦膜炎,對于陰性腦脊液檢查結果,臨床又高度懷疑隱球菌顱內(nèi)感染患者,不能輕易排除該病[8]。隱腦患者的腦脊液可呈典型的 “三高一低”腦膜炎表現(xiàn),但無隱球菌性腦膜炎的特異性。診斷除了臨床表現(xiàn)外,目前臨床常用檢查方法主要包括腦脊液常規(guī)、生化等一般檢查、隱球菌莢膜多糖抗原檢測、腦脊液墨汁染色、真菌培養(yǎng)和影像學檢查等。墨汁染色是一種傳統(tǒng)的方法,可把隱球菌莢膜染成透明。印度墨汁染色的敏感性和特異性不一,常依賴于觀察者的經(jīng)驗,在化膿性腦膜炎中有1例因莢膜抗原呈現(xiàn)假陽性,裂解的白細胞被誤認為真菌[9]。隱球菌培養(yǎng)和墨汁染色陽性是隱球菌性腦膜炎的確診依據(jù),但真菌培養(yǎng)和鑒定的周期較長(3~7d),且陽性率較低(55%~80%)[10]。 本研究結果顯示隱球菌腦膜炎患者初次腰穿,膠體金法較上述2種“金標準”法更為敏感,可達100%,適應于臨床排除診斷,對于初次腰穿腦脊液膠體金法陽性,而腦脊液涂片、腦脊液真菌培養(yǎng)陰性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者,應高度警惕隱球菌顱內(nèi)感染的可能,需多次腰穿查找病原體。表1示對照組中1例臨床確診為化膿性腦膜炎患者,膠體金法陽性,多次腦脊液培養(yǎng)均未檢出隱球菌但是培養(yǎng)出細菌,提示膠體金法檢測新型隱球菌腦膜炎雖然有很好的敏感性,但也可能出現(xiàn)假陽性。膠體金檢測方法腦脊液與抗原可能交叉反應,易被誤診為新型隱球菌性腦膜炎,需結合其它檢測方法進行診斷,原因尚須進一步研究[11]。我們認為,隱球菌莢膜多糖抗原的膠體金免疫層析法最大價值是對新型隱球菌腦膜炎的早期診斷提供思路、線索和依據(jù)。依據(jù)三種方法各自局限性,聯(lián)合三種方法檢測值得臨床推廣。

    隱球菌莢膜多糖抗原的檢測,根據(jù)現(xiàn)有文獻報道,具有高達90%以上的敏感度及特異度,已經(jīng)作為隱球菌性腦膜炎確診的依據(jù)[12,13]。跟蹤病例發(fā)現(xiàn),大部分患者莢膜抗原轉(zhuǎn)陰長達半年以上,部分患者長期治療后抗原卻一直存在體內(nèi)。研究莢膜抗原檢測對疾病預后價值的評估以及抗原檢測轉(zhuǎn)陰或者滴度效價的變化后的停藥節(jié)點等問題[14],還有待于進一步擴大臨床病例進行深入研究。

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