鋅指蛋白ZNF222在滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移與侵襲中的功能

劉建兵 趙皓琦 周 芳 陳西華 郝建卿 徐祥波 賀 斌* 王介東

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(太原,030001)；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所

人類胎盤在進(jìn)化中形成了很強(qiáng)的侵襲能力,胎盤最重要的細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞[1]，其具有的侵襲性可侵入子宮內(nèi)膜將胎盤錨定在子宮，還能侵入并重塑子宮螺旋動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)整個(gè)妊娠過程中從母血中汲取胎兒所需物質(zhì)，保證胎兒的正常發(fā)育和生長(zhǎng)[2]，而滋養(yǎng)層細(xì)胞的行為異常有可能導(dǎo)致妊娠疾病，幾乎2/3的妊娠失敗都與滋養(yǎng)層細(xì)胞異常的侵襲行為有關(guān)[3]。研究胎盤侵襲機(jī)制，有助于對(duì)這類疾病的認(rèn)識(shí)和理解。胎盤功能正常發(fā)揮既需要舊基因的表達(dá)，更需要進(jìn)化產(chǎn)生的新基因表達(dá)[4]。人類胎盤的侵襲能力在進(jìn)化中可能伴隨著新基因的產(chǎn)生，這些基因可能在人類胎盤特質(zhì)的形成中發(fā)揮重要作用。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，人類多數(shù)鋅指蛋白基因在免疫組織或生殖系統(tǒng)高表達(dá)[5-7]。有研究報(bào)道，ZNF222是在狹鼻猴類保守表達(dá)的鋅指蛋白基因[8]，在人類有表達(dá)而在嚙齒類中不表達(dá)[9]。本文對(duì)ZNF222基因在人滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能中的作用進(jìn)行初步研究，以期為人類胎盤侵襲能力形成的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本材料與細(xì)胞系

在知情同意的情況下，人體標(biāo)本來自于北京市海淀婦幼保健院的志愿者。人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo[10]培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、10 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞置37℃、5% CO2中培養(yǎng)。本研究通過了國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會(huì)審查。

1.2 試劑與儀器

①免疫組織化學(xué)常規(guī)試劑耗材：ZNF222(Gene ID：7673)兔多克隆抗體(Sigma，美國(guó))，免疫組化IgG/HRP檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋)，RNA提取常規(guī)試劑TRIzol(Invitrogen, 美國(guó))。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)試劑：SYBR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR081A)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Random primer，RNase inhibitor，Oligo(dT)，SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(大連寶生物)。③實(shí)時(shí)定量PCR引物：人類ZNF222 5'-TCTTGCGAGTCCTTCCGAAC-3'，5'-GA AGGTCACTGCCTCCTCTG-3'；GAPDH 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，5'-TCCAC CACCCTGTTGCTGTA-3'(北京賽百盛基因技術(shù))。④Western blot常規(guī)試劑耗材：BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific)，β-Actin抗體(北京康為世紀(jì)生物)蛋白對(duì)照，RIPA蛋白裂解液(Thermo Fisher Scientific)，ECL發(fā)光試劑盒(北京全式金生物)，HRP 標(biāo)記的二抗試劑盒(北京中杉金橋)。⑤Lipo3000及Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen, 美國(guó))，ZNF222 siRNA及negative control(NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成。ZNF222 siRNA共設(shè)計(jì)合成了兩條，分別為：ZNF222 siRNA-1：5'-GCCAAAGAGAAG GGA AUUU TT-3'，5'-AAAUUCCCUUCUCUUUGGCTT-3' ZNF222 siRNA-2：5'-GGUCUC AAGAUACC ACCAUTT-3'，5'-AUGGUGGUAUCUUGAGACCTT-3'，對(duì)照序列NC：5'-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。胎牛血清、1640培養(yǎng)基、HBSS(南京維森特生物)，基質(zhì)膠(BD，美國(guó))，CCK-8試劑盒(Dojind，日本)。⑥ Step-OneTM實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems，美國(guó))，NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)，AG22331型 PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf)，DYY-III型電泳儀(北京六一儀器廠)，電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、厚濾紙等(Bio-Rad，美國(guó))，RNase Free槍頭、EP管(Axygen，美國(guó))，PVDF膜(Merck Millipore，德國(guó))，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))，Sagecreation 凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)人絨毛、蛻膜及子宮內(nèi)膜組織于4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，用枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)95～98℃水浴孵育20 min行抗原修復(fù)，室溫下冷卻，蒸餾水浸洗5 min。切片表面滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，滴加5%非免疫原性動(dòng)物血清室溫封阻30 min，用ZNF222抗體(陰性對(duì)照PBS緩沖液)行一抗孵育，37℃ 60 min或4℃過夜，用相應(yīng)二抗試劑盒，按照說明書方法孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，適時(shí)終止。經(jīng)過PBS清洗后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，中性樹脂封片。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR在6孔板中，處理好的HTR8/SVneo細(xì)胞，用 TRIzol法提取總RNA并與Random primer及Oligo d(T)混合， 70℃ 10 min，再迅速置于冰上冷卻2～3 min，配制常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄體系，30℃反應(yīng)10 min，42℃保溫60 min，70℃反應(yīng)15 min后冰上冷卻，得到RNA反轉(zhuǎn)后的cDNA溶液。將轉(zhuǎn)染前后的HTR8/SVneo細(xì)胞的cDNA文庫，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ZNF222 mRNA 表達(dá) ，GAPDH作為內(nèi)參，利用ΔΔCt法統(tǒng)計(jì) mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3Westernblot檢測(cè)在長(zhǎng)滿HTR8/SVneo細(xì)胞的6孔板中，各孔加入蛋白裂解液150～200μl，加入適量蛋白酶抑制劑，置冰上30 min，每5 min前后左右晃動(dòng)一次，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，轉(zhuǎn)移至離心管，12 000轉(zhuǎn)/min，5 min，取上清液移至新離心管。將20～30 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%濃度SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，利用 Western blot方法分別進(jìn)行目標(biāo)蛋白ZNF222(1:300)與內(nèi)參蛋白β-actin(1:2 000)抗體雜交，ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)。

1.3.4細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力檢測(cè)前1天在6孔板中每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染ZNF222 siRNA 至HTR8/SVneo細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染48h后，取適量細(xì)胞種于96孔板，每一組處理重復(fù)3次，按照CCK-8試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)；transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1ZNF222基因表達(dá)定位

ZNF222基因在人絨毛外周滋養(yǎng)層區(qū)域有很高表達(dá)(圖1B)，在人蛻膜中也有較強(qiáng)表達(dá)(圖1C)，而在人子宮內(nèi)膜中表達(dá)很弱(圖1D)。

A.陰性對(duì)照；B.人絨毛；C.人蛻膜；D.人子宮內(nèi)膜。Bar=100 μm圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ZNF222表達(dá) (×200)

2.2 HTR8/SVneo細(xì)胞中ZNF222基因的敲降

在HTR8/SVneo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ZNF222 siRNA后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示 ZNF222 siRNA-1、ZNF222 siRNA-2表達(dá)量明顯降低(P=0.0376、0.0392)(圖2)； western blot法顯示 ZNF222 siRNA-1、 ZNF222 siRNA-2表達(dá)量也明顯減少(P=0.0423、0.0415)(圖3)。

圖2 RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZNF222 siRNA后ZNF222 mRNA表達(dá)

圖3 Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZNF222 siRNA后ZNF222蛋白水平

2.3 ZNF222對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響

ZNF222的敲降未改變細(xì)胞的增殖行為，ZNF222 siRNA-1(P=0.610)、 ZNF222 siRNA-2(P=0.277)(圖4)；利用transwell小室檢測(cè)HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移影響表明，ZNF222的敲降使HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移能力減弱，ZNF222 siRNA-1(P=0.0265)、ZNF222 siRNA-2(P=0.00586)；利用鋪有基質(zhì)膠的transwell小室檢測(cè)HTR8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力影響表明，ZNF222的敲降抑制了HTR8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力， ZNF222 siRNA-1(P=0.0327)、 ZNF222 siRNA-2(P=0.0412)(圖5)。

圖4 敲降ZNF222后不同時(shí)間CCK-8法檢測(cè)HTR8/SVneo細(xì)胞生長(zhǎng)

圖5 ZNF222的敲降對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

鋅指蛋白是一大基因家族，分為C2H2、C4、C6、 C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H以及聯(lián)合型等多種類型，其中C2H2型最為多見，含該結(jié)構(gòu)蛋白占人類蛋白總數(shù)的2%、700個(gè)左右[11]，在DNA、蛋白質(zhì)和RNA的相互識(shí)別中發(fā)揮重要作用。ZNF222屬C2H2型鋅指蛋白，位于人類19q13.31，全長(zhǎng)7787bp，是一個(gè)編碼蛋白的基因。Shannon等[8]研究表明，ZNF222與ZNF221，ZNF155、ZNF230、ZNF223、ZNF284、ZNF224、ZNF225、ZNF234及ZNF226聚集于同一段染色體中，其中人的ZNF226及ZNF234與小鼠的Zfp61相似度最高，78%～81%的氨基酸序列完全一致，而ZNF222、ZNF221，ZNF155、ZNF230、ZNF223、ZNF284、ZNF224、ZNF225在小鼠中沒有極其相似的基因，但與Zfp61有一定相似[9]。由此推測(cè)，人的這8個(gè)ZNF基因可能是由Zfp61、ZNF234及ZNF226的共同祖先基因衍生出來的新基因。然而在小鼠中，該祖先基因沒有衍生出新的基因或丟失了祖先基因的復(fù)制體，從而導(dǎo)致小鼠中只有Zfp61單個(gè)基因。

目前，有關(guān)ZNF222表達(dá)的相關(guān)報(bào)道很少。Shannon等[9]研究顯示，ZNF222在人的心臟、胎盤、骨骼肌、胰腺、小腸、卵巢、脾臟、前列腺及胸腺中表達(dá)量較高，睪丸、結(jié)腸、白血球、腦及肝臟中表達(dá)量較少，在肺和腎臟中表達(dá)很少或沒有表達(dá)。本研究中，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法顯示ZNF222在人妊娠早期絨毛有很高的表達(dá)，特別是在絨毛外周有很強(qiáng)的表達(dá)，而在蛻膜及非妊娠狀態(tài)下的子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)很弱甚至沒有。這種表達(dá)模式提示ZNF222可能在人類妊娠過程中有一定作用，特別是在胎盤形成過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲中可能具有重要作用。

鋅指蛋白在真核生物中表達(dá)廣泛, 參與細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等多種重要生命過程。在基因表達(dá)過程中，鋅指蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在DNA、蛋白質(zhì)及RNA的相互識(shí)別中發(fā)揮著重要作用[12]。目前，鋅指蛋白功能研究顯示，鋅指蛋白在人類疾病的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞行為中發(fā)揮著重要作用。如，ZNF367受miR-195調(diào)控而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[14-15]；ZNF488能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路而提高鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力[16]；ZNF224通過與DEPDC1形成復(fù)合物能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡，從而在膀胱癌變過程中發(fā)揮著重要作用[17]。本研究顯示，ZNF222顯著抑制了HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力，預(yù)示ZNF222的表達(dá)可能在人類胎盤形成過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜直到子宮肌層及侵入子宮螺旋動(dòng)脈等行為中發(fā)揮一定作用，也可能在滋養(yǎng)層分化異常的相關(guān)疾病發(fā)生中發(fā)揮著一定作用。但有關(guān)ZNF222調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞行為的分子機(jī)制以及在疾病發(fā)生發(fā)展中可能作用，還有待進(jìn)一步研究和探索。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法顯示靈長(zhǎng)類新進(jìn)化產(chǎn)生的鋅指蛋白ZNF222在人妊娠早期的絨毛中，特別是外周細(xì)胞中高表達(dá)，并且通過基因干擾技術(shù)證實(shí)ZNF222基因沉默抑制了人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo的遷移和侵襲。為鋅指蛋白在人類生殖行為中的功能研究提供了新的證據(jù)，并為人滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制研究提供了新的線索。