北冰洋來源白色念珠菌拮抗菌株的分離與鑒定

邱昊旻，劉博超，馬啟晨，王曉彤，權(quán)春善，金黎明*，宮小明

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；

2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041）

白色念珠菌（Canidia albicans）為念珠菌屬，又稱白假絲酵母菌，是一種酵母樣條件性致病真菌，廣泛存在于自然界，可在健康人和畜禽的口腔、呼吸道、消化道黏膜和腸道等處寄居，當(dāng)維生素缺乏、營養(yǎng)不良、抵抗力下降、機(jī)體內(nèi)微生態(tài)平衡遭到破壞時(shí)容易引發(fā)疾病[1-2]。目前，白色念珠菌拮抗菌株的篩選來源主要集中于陸地和海洋，其中，海洋微生物由于生存環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫和稀營養(yǎng)的特點(diǎn)，為了長期適應(yīng)復(fù)雜的海洋環(huán)境而生存，可能產(chǎn)生區(qū)別于陸生微生物的次生代謝產(chǎn)物，成為近年來研究的熱點(diǎn)[3-12]。王勇勇等[13]從渤海灣不同站位分離獲得的海洋絲狀真菌中篩選獲得4株對(duì)野生型白色念珠菌SC5314具有較強(qiáng)抑菌活性的海洋真菌，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為65 g/mL、19 g/mL、54 g/mL、23 g/mL；ZHANG Y等[14]從褐藻囊藻（Colpomenia sinuosa）中分離到一株對(duì)白色念珠菌有較好的抑制效果的海洋真菌黑曲霉（Aspergillus niger）EN-13；WEN L等[15]從臺(tái)灣地區(qū)紅樹林中分離到一株對(duì)白色念珠菌有較好抑制效果的真菌擬青霉屬（Paecilomycessp.）Tree1-7。但關(guān)于抑制白色念珠菌的北冰洋來源海洋微生物的研究鮮見報(bào)道。

本研究從北冰洋沉積物樣品中篩選能夠抑制白色念珠菌的海洋微生物，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究其抑菌譜。為進(jìn)一步研究其具有抗菌性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，尋找可能的新的抗菌藥物奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品：中國第六次北極考察的北冰洋沉積物樣品。

1.1.2 指示菌

白色念珠菌（Canidia albicans）SN250、大腸桿菌（Escherichiacoli）CMCC44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）CGMCC1.1616、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CICC 21484、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）BNCC 194496、屎腸球菌（Enterococcus faecium）BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）BNCC 186113：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 主要試劑

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）試劑：大連寶生物公司。瓊脂、酵母浸粉、葡萄糖、胰化蛋白胨（均為生化試劑）：奧博星生物技術(shù)公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB海水培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉10 g，海水1 L，pH 7.0。液體培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH 7.0。

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2。

腦心浸液肉湯（brainheart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，脫水小牛腦浸粉12.5 g/L，脫水牛心浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖2 g/L，Na2HPO42.5 g/L，pH 7.0。

MRS培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海洋微生物的分離和純化

采用涂布平板法分離海洋微生物菌株[16]。取0.5 g沉積物樣品，加入4.5 mL陳海水，混勻后靜置2 h。采用陳海水10倍梯度稀釋至10-1～10-7，選取稀釋度為10-4～10-7的稀釋液50 μL涂布于LB海水培養(yǎng)基平板。28℃條件下倒置培養(yǎng)1～2 d，獲得單菌落。挑取單菌落，采用平板劃線法純化菌株，并進(jìn)行編號(hào)、保藏。

1.3.2 白色念珠菌拮抗菌株的初篩

采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩[16]。將白色念珠菌培養(yǎng)液以0.1%（V/V）的接種量加入LB培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，待凝固后，將上述分離純化的菌株劃線于培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈，將具有抑菌圈的單菌落作為初篩菌株。

1.3.3 白色念珠菌拮抗菌株的復(fù)篩

參考張靜楠等[16]的方法，將初篩獲得的菌株接種于100 mL LB海水液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3～4d，得到的發(fā)酵液在4℃、8000r/min條件下離心10min，取上清液旋蒸濃縮，并將濃縮液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到5 mL濃縮發(fā)酵液。

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定濃縮發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的抑菌活性[16]。將白色念珠菌以0.1%（V/V）的接種量加入LB培養(yǎng)基中，待平板凝固后，用打孔器打直徑為9 mm的孔，每孔加入400 μL濃縮發(fā)酵液，37℃培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，當(dāng)抑菌圈直徑＞9 mm，認(rèn)為具有抑菌活性[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定：參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。生理生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目包括檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)和尿素實(shí)驗(yàn)等。

分子生物學(xué)鑒定：篩選出的菌株在LB海水培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)36 h。采用煮沸法提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA1.0μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture 1.0 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，引物27F（10 μmol/L）1.0 μL，引物1492r（10 μmol/L）1.0 μL，10×Loading Buffer 4.0 μL，無菌雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位[20]。

1.3.5 抑菌譜的測(cè)定

將篩選得到的菌株按0.1%（V/V）的接種量接種到200mL LB海水液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清，50℃條件下旋蒸至干，加入3 mL超純水，將濃縮液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到粗發(fā)酵液。

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)8種病原微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌）的抑菌活性。其中，肺炎克雷伯菌采用NB培養(yǎng)基；鮑曼不動(dòng)桿菌采用BHI培養(yǎng)基；屎腸球菌采用MRS培養(yǎng)基；其余5種常見病原微生物采用LB培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基融化后，室溫放置至40℃左右，接入100 μL病原微生物，輕搖混勻后倒平板，待平板凝固后用直徑9 mm的打孔器打孔，孔中加入300 μL海洋微生物的粗發(fā)酵液，37℃條件下培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)抑菌圈的直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離純化

從北冰洋沉積物樣品中共分離純化得到314株菌，編號(hào)為1～314。

2.2 白色念珠菌拮抗菌株的篩選

采用對(duì)峙培養(yǎng)法從314株菌株中篩選出4株對(duì)白色念珠菌有明顯抑制作用的菌株，菌株編號(hào)為56#、83#、95#、103#。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定4株菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株56#的抑菌圈直徑最大，為（32.14±0.72）mm，其次為菌株83#，抑菌圈直徑為（28.24±0.41）mm，菌株103#的抑菌圈最小，為（20.22±0.32）mm。其中，菌株56#發(fā)酵液的抑菌效果見圖1。由圖1可知，接種菌株56#濃縮發(fā)酵液的孔周圍出現(xiàn)明顯的透明圈。

表1 菌株抑菌圈測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of inhibition zone of strains

圖1 菌株56#發(fā)酵液的抑菌效果Fig.1 Inhibition effect of fermentation broth of strain 56#

2.3 菌株的鑒定

菌株56#在LB海水培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖2。由圖2可知，菌株56#的菌落呈微隆起的圓形，黃白色，無褶皺。在電鏡下可見，菌株為明顯的桿狀，并有芽孢。

圖2 菌株56#的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colonial(a)and cell(b)morphology of strain 56#

菌株56#的生理生化鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，菌株56#為革蘭氏陽性菌，檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)均呈陽性；吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)和尿素實(shí)驗(yàn)均呈陰性。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]并結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，初步判定菌株56屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表2 菌株56#的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain 56#

采用MEGA 6.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株56#基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 56#based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株56#與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株56#為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 抑菌譜測(cè)定結(jié)果

菌株56#對(duì)8種病原微生物的抑菌效果見表3。由表3可知，菌株56#對(duì)大腸桿菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌都有一定的抑制作用，是一株廣譜抗菌的海洋微生物。

表3 菌株56#抑菌譜的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of antimicrobial spectrum of strain 56#

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從北冰洋沉積物樣品中分離純化出314株菌株，通過初篩得到4株對(duì)白色念珠菌有明顯拮抗作用的菌株，通過復(fù)篩，得到1株拮抗效果最好的菌株，編號(hào)為56，其抑菌圈直徑為（32.14±0.72）mm。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株56#為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其對(duì)大腸桿菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等多種食源性致病菌都有一定的抑制作用，是一株廣譜抗菌的海洋微生物。