菌株LYH18發(fā)酵條件優(yōu)化及肌氨酸氧化酶的分離純化

遲乃玉，劉 洋，于 爽，希 倫，李美玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，SOX）EC.1.5.3.1是酶法測定肌酐中的關(guān)鍵酶，可催化肌氨酸中的N-甲基的氧化還原，可偶聯(lián)肌酐酶和肌酸酶將肌酐降解[1-3]。作為測定血清或尿液中肌酐含量的關(guān)鍵酶之一，被用于診斷腎臟的健康程度[4-6]。為了滿足工業(yè)用酶的需求，研究學(xué)者們從肌氨酸氧化酶的分布、酶學(xué)性質(zhì)以及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了大量研究[7-10]。MORI N等[7]研究發(fā)現(xiàn)，真菌Cylindrocarpon didymiumM-1可產(chǎn)單聚體SOX，測得該酶分子質(zhì)量為48 kDa，最適pH值為7.5，最適溫度為40℃。劉輝等[8]從菜園土壤中篩選出一株芽孢桿菌（Bacillussp.）BSD-8，純化后的酶在十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中均顯示單一條帶，為單聚體SOX，分子質(zhì)量為51 kDa，米氏常數(shù)（Km）值為3.1 mmol/L，最適合pH 8.5，在7.0～10.0之間穩(wěn)定，最適溫度為60℃，60℃處理10 min，仍有94%的酶活，是目前熱穩(wěn)定性最好的。SUZUKI N等[9]從棒狀桿菌Corynebacteriumsp.U-96中獲得由四個亞基組成的SOX，亞基大小分別為10 kDa、21 kDa、44 kDa、110 kDa，酶的米氏常數(shù)（Km）值為3.8 mmol/L，最適pH 8.3，最適溫度37℃，在45℃處理10 min，酶完全失活。KIM J M等[10]篩選到1株反硝化產(chǎn)堿菌（Alcaligenes denitrificans），SDS-PAGE有兩條條帶，分別為55 kDa、100 kDa，最適pH 8.0，最適溫度為37℃，30℃以下穩(wěn)定，酶的米氏常數(shù)（Km）值為4.2 mmol/L。

在臨床試驗中，血清肌酐濃度是判斷腎功能的重要指標(biāo)。目前肌酐的測定通常用Jaffé法測定[11]。該方法是基于化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的，特異性較差，血清中許多化學(xué)物質(zhì)會干擾測定結(jié)果，這使得疾病的診斷變得困難[12]。由于酶催化反應(yīng)具有比一般化學(xué)反應(yīng)更高的特異性，開發(fā)出酶促肌酐的測定方法為近年來的研究熱點[13-15]。本實驗對海洋來源的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18進(jìn)行研究，對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對該酶進(jìn)行分離純化，分析其分子質(zhì)量，以期為肌氨酸氧化酶工業(yè)化生產(chǎn)、酶法制備肌氨酸氧化酶工藝以及肌氨酸氧化酶法檢測肌酐試劑盒的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18：分離自遼寧省大連渤海灣海域的海泥海水樣品，現(xiàn)由大連大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實驗室保藏。

1.1.3 化學(xué)試劑

肌酸（分析純）：大連凱美化工有限公司；蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：北京TIANGEN生物公司；葡聚糖凝膠G-75：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，NaCl 1%，水1 L；pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：肌酸，5.0 g；酵母膏，0.5 g；硫酸鎂，0.5 g；磷酸氫二鉀，0.5 g；磷酸二氫鉀，2 g；海水1 L；pH 7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：肌酸，8.0 g；酵母膏，5.0 g；硫酸鎂，0.5 g；磷酸氫二鉀，0.5 g；磷酸二氫鉀，2 g；海水1 L；pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在0.1MPa、121℃高壓蒸汽滅菌20min[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱：蘭州方盛生物科技有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本OLYMPUS公司；P3031移液器：美國吉而遜實驗儀器有限公司；APL-204電子天平、pH-3G pH計：陜西鼎盛儀器公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

菌株活化：在無菌條件下，將芽孢桿菌LYH18接種到固體LB培養(yǎng)基中并在25℃靜置培養(yǎng)24 h，三區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，4℃條件下儲存，以備后續(xù)實驗使用。

種子培養(yǎng)：在無菌條件下，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體，接種于裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：在無菌條件下，將上述種子液按1%的量接種于裝液量200 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 肌氨酸氧化酶粗酶液制備

將通過最適發(fā)酵條件培養(yǎng)的發(fā)酵液，4℃條件下8 000 r/min離心15 min，收集菌體，用50 mmol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行吹打沖洗后離心，重復(fù)3次，再將其懸浮于兩倍體積的緩沖液中。通過超聲波200 W破3 s停3 s條件下將細(xì)胞破碎，4℃條件下12 000 r/min離心30 min，取上清，得到粗酶液。

1.3.3 肌氨酸氧化酶酶活測定方法[17-19]

將粗酶液0.1 mL加入到0.9 mL的焦磷酸鈉緩沖液（含0.1 mol/L肌氨酸）中，于37℃反應(yīng)10 min，再加入0.25 mL 0.1 mol/L的醋酸終止反應(yīng)，加入1.5 mL 20%的乙酸銨溶液（含0.04%乙酰丙酮），于37℃反應(yīng)40 min后，在波長410 nm處測吸光度值（OD410nm值）。

產(chǎn)肌氨酸氧化酶酶活定義：37℃每分鐘分解1 μmol肌氨酸的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.4 產(chǎn)酶曲線和生長曲線測定

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入1%的菌液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。無菌條件下，在不同時間（0～120 h），對發(fā)酵液進(jìn)行取樣，0～60 h，每隔4 h測OD410nm，60～120 h，每隔12 h測OD410nm值，計算酶活，繪制時間-酶活曲線；0～12h，每隔3h測OD600nm值，12～60 h，每隔6 h測OD600nm值，60～120 h，每隔12 h測OD600nm值，繪制菌株生長曲線。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

（1）誘導(dǎo)物對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同誘導(dǎo)物（肌酸、肌酐、肌氨酸、氯化膽堿、不加誘導(dǎo)物的為空白對照組），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h。測定粗酶液酶活。相對酶活：以該組最大酶活為100%，其他酶活占其百分比為相對酶活，下同。

（2）不同碳源對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同種類的碳源（肌酸、果糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳糖、葡萄糖），接種1%的菌液在25℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h，測定粗酶液酶活。

（3）碳源添加量對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同濃度（0.25%～1.50%，梯度為0.25%）的肌酸，接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定粗酶液酶活。

（4）不同氮源對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同種類氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、明膠、酪蛋白），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定酶活。

（5）氮源添加量對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同濃度的最優(yōu)氮源（0.4%～2.0%，梯度為0.4%），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定酶活。

（6）無機鹽對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4添加量分別設(shè)為0.030%～0.060%，梯度為0.010%，25℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定粗酶液酶活。

（7）初始pH對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

用酸堿指示劑調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基至不同的初始pH值（pH 5～10，梯度為0.5），25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h，測定粗酶液酶活。

（8）培養(yǎng)溫度對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于不同溫度下（15～35℃，梯度為5℃），25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定粗酶液酶活。

（9）裝液量對菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

設(shè)置不同裝液量（10mL/100 mL～40 mL/100 mL梯度為10 mL，60 mL/100 mL），按1%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定粗酶液酶活。

1.3.6 酶的分離純化

硫酸銨沉淀：向1.3.2節(jié)中制備的粗酶液中緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度達(dá)到20%，4℃靜置過夜后，在4℃、8000r/min條件下離心10min，取上清液，備用。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到80%，4℃靜置過夜后8 000 r/min條件下冷凍離心10 min，棄去上清，將沉淀重懸于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.4），將經(jīng)過硫酸銨沉淀后的酶液裝入透析袋中，用pH 7.4的PBS緩沖液作為交換液進(jìn)行透析，每隔12 h進(jìn)行更換一次緩沖液，至無SO42-為止。將透析后的樣品加入超濾管，4℃、8 000 r/min條件下離心10 min后保留上清液，備用。

Sephadex G-75凝膠過濾層析：取6 mL透析后的樣品加入用PBS（pH 7.4）緩沖液預(yù)平衡的Sephadex G-75凝膠過濾層析柱。在0.1MPa柱壓、流速0.5mL/min條件下，用3倍柱床體積的PBS緩沖液（pH 7.4）洗脫后，再用含0～1 mol/L氯化鈉的PBS緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行線性梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，每管收集6 mL，測定每個收集管肌氨酸氧化酶活力和總蛋白含量。在波長280 nm處的紫外光下檢測樣品。在線測定酶活后，收集合并有酶活洗脫液。

1.3.7 酶的純度及分子質(zhì)量測定

通過SDS-PAGE測定肌氨酸氧化酶的分子質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為兔磷酸化酶B（97.4 kDa）、牛血清白蛋白（66.2 kDa）、兔肌動蛋白（43.0 kDa）、牛碳酸酐酶（31.0 kDa）、胰蛋白酶抑制劑（20.1 kDa）、雞蛋清溶菌酶（14.4 kDa）。采用12%的分離膠、5%的濃縮膠，電泳2 h結(jié)束后，用R250染色液漫過膠，置于搖床，25℃、45 r/min條件下染色1 h，后加脫色液于脫色搖床25℃、45 r/min條件下脫色12 h，期間每3 h更換一次脫色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線和產(chǎn)酶曲線

由圖1生長曲線可知，芽孢桿菌LYH18在0～18 h隨時間的延長生長量急劇增加，說明該菌適應(yīng)性很強，遲滯期很短甚至沒有，0～18 h為其生長的對數(shù)期；18～50 h生長量穩(wěn)定，為穩(wěn)定期，此期細(xì)菌增殖數(shù)與死亡數(shù)幾乎相等，芽孢和大多數(shù)酶亦多在此期形成；50 h后生長量降低，進(jìn)入衰退期，72 h之后該菌幾乎停滯生長。

圖1 芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶與生長曲線Fig.1 Sarcosine oxidase production and growth curve of BacillusLYH18

由圖1產(chǎn)酶曲線可知，該菌株在0～30 h，粗酶液酶活極低，基本為零，因該酶為滯后合成酶，在生長的前期并不產(chǎn)酶；36～84 h酶活隨時間增長而增高，說明36 h后即穩(wěn)定期后期，該菌開始產(chǎn)SOX；在84 h時達(dá)到最大值，為1.65 U/mL；在84 h后酶活逐漸降低；該菌在72 h時酶活較高，十分接近最大值，結(jié)合生長曲線特性，設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)時間為72 h。

2.2 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 誘導(dǎo)物對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

SOX是一種誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵培養(yǎng)時必須加入一定量的誘導(dǎo)物。不同誘導(dǎo)物對芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響見圖2。

圖2 不同誘導(dǎo)物對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.2 Effect of different inducers on sarcosine oxidase production by BacillusLYH18

由圖2可知，肌酸對酶的誘導(dǎo)作用最強，其次為肌酐，依次為肌酸＞肌酐＞肌氨酸＞氯化膽堿，因此，選用肌酸作為發(fā)酵誘導(dǎo)物。進(jìn)一步查閱氯化膽堿相關(guān)資料可知，其雖然可誘導(dǎo)該菌株合成SOX，但并不是SOX底物，不能被SOX分解[20]。

2.2.2 不同碳源對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入1%的不同碳源進(jìn)行發(fā)酵，并測定酶活性，結(jié)果見圖3。由圖3可知，肌酸、乙酸鈉、葡萄糖對菌株產(chǎn)酶活性有促進(jìn)作用，其中肌酸＞乙酸鈉＞葡萄糖；肌酸的促進(jìn)作用十分顯著，在加入1%的肌酸后，SOX活性比對照組顯著提高；而果糖、檸檬酸鈉、乳糖則對菌株產(chǎn)酶有抑制作用，抑制作用大小為檸檬酸鈉＞乳糖＞果糖。因此，肌酸可作為誘導(dǎo)物且為唯一碳源。

圖3 不同碳源對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.3 肌酸加入量對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入不同濃度的肌酸進(jìn)行發(fā)酵，測定其酶活性，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在較低濃度下，肌酸對酶的產(chǎn)生具有顯著影響。隨著肌酸的添加，酶的產(chǎn)生能力增加，至肌酸添加量為1%時達(dá)到最大值，肌酸添加量＞1.0%之后，對菌株產(chǎn)酶能力有抑制作用。因此，選擇最適肌酸添加量為1.0%。

圖4 不同肌酸添加量對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.4 Effect of different creatine addition on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.4 不同氮源對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入1%的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、明膠、酪蛋白作為微生物的補充氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，粗酶液酶活測定結(jié)果見圖5。由圖5可知在所測定的氮源中，酵母膏和玉米漿對該菌株產(chǎn)SOX有較大促進(jìn)作用，酵母膏的促進(jìn)作用尤其明顯。因此，選擇酵母膏作為該菌產(chǎn)酶的最適氮源[21]。酵母類有機氮源中蛋白質(zhì)含量高（蛋白質(zhì)占干菌體總質(zhì)量50%以上），含有18種氨基酸，種類齊全，維生素和礦物質(zhì)等含量豐富，是微生物菌體培養(yǎng)與產(chǎn)物發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)有機氮源[22]。

圖5 不同氮源對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.5 酵母膏添加量對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

以酵母膏為最優(yōu)氮源，在培養(yǎng)基中加入不同量的酵母膏，粗酶液酶活測定結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)酵母膏添加量為0.8%時，酶活最高；添加量1.0%、1.2%時，相對酶活均在60%以上；添加量為0.4%、2.0%時，相對酶活不足60%，酵母膏添加量過高或過低均不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。因此，選擇最適酵母膏添加量為0.8%。

圖6 不同酵母膏添加量對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.6 Effect of different yeast extracts addition on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.6 無機鹽最適添加量對菌株LYH18發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由表1可知，無機鹽K2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4對發(fā)酵產(chǎn)酶均有一定的影響。且當(dāng)K2HPO4添加量為0.05%時，肌氨酸氧化酶相對酶活最高；MgSO4·7H2O添加量為0.05%時，肌氨酸氧化酶相對酶活最高，而當(dāng)MgSO4·7H2O添加量＞0.05%時，相對酶活逐漸降低；KH2PO4添加量為0.05%時，相對酶活最高，且濃度過高或過低均不利于產(chǎn)酶，分析原因可能無機鹽的過量缺乏或累積均會抑制產(chǎn)酶。因此，確定各種無機鹽最時添加量為K2HPO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.20%。

表1 無機鹽添加量對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Table 1 Effect of inorganic salt addition on sarcosine oxidaseproduction byBacillusLYH18

2.2.7 培養(yǎng)基初始pH值對菌株LYH18產(chǎn)酶的影響

酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，酶不能夠在過酸或過堿條件下具有較高活性甚至?xí)セ钚訹23]。為研究該菌株產(chǎn)SOX的最適起始pH，以0.5為梯度，在pH 5～10之間選擇了11個pH值，測定粗酶液酶活力，結(jié)果見圖7。由圖7可知，初始pH值在5.5～7.0之間，酶活隨初始pH值增加而增加，初始pH值7.0時酶活達(dá)到最大值；初始pH值在7.5～10.0之間時，酶活隨著pH值增加而降低；初始pH值＜5.5及＞8.5時，酶活極低，趨近于零，說明酸堿環(huán)境對該菌株產(chǎn)酶均有明顯抑制作用。因此，確定該菌株的最適產(chǎn)酶初始pH值為7.0。

圖7 培養(yǎng)基起始pH值對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.7 Effect of initial pH of medium on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.8 培養(yǎng)溫度對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

一般而言，溫度越高，化學(xué)反應(yīng)速率越快，在一定溫度范圍內(nèi)，酶的催化作用也是如此。但酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，溫度太高可以使其發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變性，使其失去酶的催化活性[24]。為研究該菌株產(chǎn)SOX的最適溫度，將發(fā)酵溫度分別控制在（15～35℃，梯度為5℃），發(fā)酵培養(yǎng)72 h后，測定酶活，結(jié)果見圖8。由圖8可知，溫度在15～25℃時，酶活力隨著溫度升高而升高；當(dāng)溫度為25℃時，酶活力達(dá)到最大值0.45 U/mL；當(dāng)溫度高于25℃之后，酶活力呈下降趨勢，酶活在20～30℃能保持75%以上相對酶活。因此，確定該菌株發(fā)酵最適溫度為25℃。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.8 Effect of different culture temperature on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.9 裝液量對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

考察裝液量對菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響，測定酶活及生長量，結(jié)果見圖9。由圖9可知，當(dāng)培養(yǎng)基裝液量從10 mL/100 mL增加至40 mL/100 mL時，產(chǎn)酶能力增加了2倍以上，繼續(xù)提高裝液量后，產(chǎn)酶能力迅速降低，分析原因可能是該菌株為好氧菌，較少通氣量有利于菌株產(chǎn)酶，但當(dāng)氧氣供應(yīng)太少會嚴(yán)重影響菌體生長，而最終影響酶的產(chǎn)生[23-24]。因此，最適裝液量為40 mL/100 mL。

圖9 通氣量對芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.9 Effect of ventilation on sarcosine oxidase production by BacillusLYH18

2.3 肌氨酸氧化酶的分離純化

2.3.1 硫酸銨分級沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和純化蛋白，利用此法可從粗酶液中分離出較純的SOX酶液，結(jié)果見圖10。由圖10可知，當(dāng)硫酸銨鹽飽和度為50%時，開始可以檢測出SOX活性，隨著硫酸銨鹽飽和度的增加，酶活性不斷增加，當(dāng)硫酸銨鹽飽和度達(dá)到70%時，活性最高，因此，確定SOX在硫酸銨鹽飽和度為50%～70%時沉淀下來。

圖10 硫酸銨對肌氨酸氧化酶的分級沉淀Fig.10 Fractionation precipitation of sarcosine oxidase by ammonium sulfate

2.3.2 凝膠過濾層析

將硫酸銨鹽析純化后的酶液經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析后，洗脫曲線見圖11。由圖11可知，出現(xiàn)7個吸收峰，每個吸收峰代表一種蛋白，說明分離出7種蛋白，對7種蛋白的收集管分別測定酶活，結(jié)果可知，僅有37號～56號管的收集液中有SOX活性。

圖11 硫酸銨沉淀后肌氨酸氧化酶經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析結(jié)果Fig.11 Sephadex G-75 gel filtration chromatography results of sarcosine oxidase after ammonium sulfate precipitation

2.3.3 SDS-PAGE電泳

純化后的肌氨酸氧化酶的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果見圖12。由圖12可知，所得純化SOX顯示為一個單一的條帶，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比較計算，表示得到了芽孢桿菌LYH18所產(chǎn)電泳純、分子質(zhì)量為43 kDa的肌氨酸氧化酶。

圖12 純化后肌氨酸氧化酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.12 SDS-PAGE electrophoretogram of purified sarcosine oxidase

3 結(jié)論

本實驗選擇的海洋來源的芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18為革蘭氏陽性菌，無致病性，通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化實驗，結(jié)果表明，其最適產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：肌酸添加量1.0%，酵母膏添加量0.8%，MgSO4·7H2O添加量0.05%，KH2PO4添加量0.2%，K2HPO4添加量0.05%，初始pH7.0。最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度25℃，通氣量40mL/100mL。通過硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-75凝膠過濾層析從粗酶液中純化出電泳純的肌氨酸氧化酶，純化后酶活為4.45 U/mL，純化倍數(shù)為2.66倍。SDS-PAGE結(jié)果顯示，肌氨酸氧化酶的分子質(zhì)量為43 kDa，為以芽孢桿菌作為“細(xì)胞工廠”工業(yè)化生產(chǎn)肌氨酸氧化酶及肌酐試劑盒的研究奠定了理論基礎(chǔ)。