免疫檢查點分子在子宮內膜癌中的表達及臨床意義

張麗萍，林雪萍，宋輝，雷萍，朱巧英

610045成都，四川省婦幼保健院 檢驗科

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)3大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界女性惡性腫瘤的第6位[1]。近年來，我國女性EC發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2- 3]。早期EC主要以手術治療為主，預后良好，5年生存率可達74%～91%[4]。而對于轉移或復發(fā)性患者，化療、放療等治療方法療效有限，5年生存率僅20%～26%[4]，迫切需要探索新的有效的治療方法。2013年，Science雜志將腫瘤免疫治療列為重要的科學突破，提示免疫療法將在癌癥治療領域發(fā)揮里程碑式的作用[5]。其中，免疫檢查點抑制劑(抗PD-1/PD-L1)已經用于治療多種實體腫瘤，且療效顯著。然而，目前免疫檢查點抑制劑療法應用于EC仍處于試驗階段。

免疫檢查點分子異常表達是腫瘤免疫逃逸的機制之一。由癌細胞、DC細胞、巨噬細胞或骨髓來源的抑制細胞表達的抑制性配體，與T細胞表面受體分子結合后激活負性通路，抑制T細胞增殖或抗腫瘤活性[6]。目前已發(fā)現(xiàn)多條免疫檢查點通路與腫瘤免疫逃逸相關，如PD-1/PD-L1,CTLA-4/CD80，TIM-3/Gal-9和LAG-3/FGL1[7- 9]。在EC中，免疫檢查點的研究目前主要集中在PD-1/PD-L1通路。2013年，美國癌癥基因組圖譜( The Cancer Genome Atlas, TCGA )項目將373例EC分為4種分子亞型：POLE突變型(7%)；微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(microsatellite instability，MSI)(28%)；拷貝數(shù)低型(39%)和拷貝數(shù)高型 (26%)[10]。之后，Stelloo等[11]通過免疫組化、一代測序等技術將EC分為POLE突變型，MSI型，無特異性分子變異(no specific molecular profile, NSMP)和TP53突變型，分別對應于上述TCGA的四種分子亞型。研究發(fā)現(xiàn)，POLE突變型和MSI亞型的腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)明顯升高[10]，而高TMB的腫瘤更容易從PD-1/PD-L1抑制劑中治療獲益[12- 13]。此外，POLE突變的EC組織中浸潤T細胞、CD8+ T細胞以及PD-1表達顯著升高[14]。近期的幾個案例報道也顯示，PD- 1單抗治療POLE突變型EC療效顯著[15- 16]。這些結果提示POLE突變與MSI亞型的EC可能更適合PD-1/PD-L1阻斷治療[17- 18]。然而，其他各種免疫檢查點分子在EC組織中的表達及意義目前并不清楚，限制了其他免疫療法的應用及患者篩選。

本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫中最新的EC病例及其基因數(shù)據(jù)(n=521)，驗證了4種分子亞型與患者臨床特征以及腫瘤免疫表型的關系。同時分析了多種免疫檢查點分子在EC中的表達情況，及其與腫瘤微環(huán)境、患者預后的關系。這些結果揭示了不同EC亞型中各種免疫抑制分子的表達特征，為免疫治療在EC中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中EC病例信息

截止2018年11月，TCGA數(shù)據(jù)庫共收集EC患者560例。下載患者臨床信息、腫瘤組織全外顯子測序數(shù)據(jù)(maf文件)、RNA-seq數(shù)據(jù)(counts文件)。經整理，三類數(shù)據(jù)齊備的病例數(shù)為521例，可用于后續(xù)分析。

1.2 生物信息學分析

根據(jù)TCGA下載的全外顯子測序結果(maf文件)，采用MSIseq軟件[19]對腫瘤的MSI狀態(tài)進行預測。POLE、TP53基因的突變信息直接從maf文件中提取。對于POLE基因，選取其核酸外切酶結構域的突變，這些突變導致DNA聚合酶ξ失去錯配修復功能，從而廣泛引起基因突變[17]。按照Stelloo提出的基因分型規(guī)則，將EC組織分為POLE突變型、MSI型、NSMP型以及TP53突變型[11]。

對于RNA-seq的原始reads數(shù)據(jù)，采用TPM(transcripts per million)的方法進行標準化處理[20]。各種免疫細胞、腫瘤間質細胞在腫瘤組織中的豐度由這些細胞的基因標志物進行計算?；驑酥疚锊捎肞rat等[21]整理的不同免疫細胞、間質細胞的標志基因。具體某種細胞豐度的計算采用文獻報道的方法[22]，即以該細胞所有標志基因的平均表達值作為細胞豐度指標。

1.3 統(tǒng)計學分析

四種EC分子亞型與病例組織學類型、分期、分級、年齡的相關性采用卡方檢驗或Fisher精確法檢驗。各種免疫細胞成分、免疫檢查點分子在不同分子亞型、不同組織學類型中的表達差異采用t檢驗或秩和檢驗。TMB在不同患者組別中的差異分析采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier曲線比較患者總生存期(overall survival, OS)和無復發(fā)生存期(relapse-free survival, RFS)，log-rank檢驗計算統(tǒng)計學顯著性。對于不同的免疫檢查點基因，通過基因表達值的中位值將患者分為高、低表達兩組。FGL1基因表達值與各種細胞成分的相關性分析采用Pearson方法。所有統(tǒng)計計算采用R軟件(版本3.5.1)進行，雙側P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基于全外顯子測序和RNA測序數(shù)據(jù)對EC進行分子分型

521例EC患者的中位年齡64歲(區(qū)間31 ～ 90歲)。按照病理類型，子宮內膜樣腺癌389例(74.7%)，漿液性腺癌110例(21.1%)，混合型癌22例(4.2%)。病理學分級為G1、G2、G3的患者分別為96例(18.4%)、115例(22.1%)、310例(59.5%)。按照Stelloo的分型規(guī)則[11]，全部患者被分為POLE突變型(41例)、MSI型(154例)、NSMP型(171例)和TP53突變型(155例)。四種分子亞型與組織病理學類型、腫瘤分期、腫瘤分級、患者年齡均具有顯著關聯(lián)(圖1A)。其中TP53突變型主要與漿液性癌、腫瘤高分級、患者高年齡相關。與TP53突變型/NSMP型相比，POLE突變型和MSI型EC中總白細胞(CD45)、T淋巴細胞及CD8+T細胞成分顯著升高(P<0.001，圖1B)。然而，這些細胞在POLE突變型和MSI型之間并沒有顯著差異。生存分析表明，四種分子亞型中，POLE突變型預后較好，TP53突變型預后最差(OS和RFS均為P<0.001，圖1C)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中EC的分子分型

Figure 1. Molecular Subtypes of EC from TCGA

A.Correlationbetweenfourmolecularsubtypesandclinicalandpathologicalparameters.PvaluewascalculatedbyChi-squaretestorFisherexacttest.B.Analysisofinfiltratinglymphocyteabundanceinfourmolecularsubtypes.Pvaluewascalculatedbyt-test.C.Kaplan-MeiermethodwasusedtoplotOSandRFSoffourmolecularsubtypes.Pvaluewascalculatedbylog-ranktest.

2.2 免疫檢查點分子在4種EC分子亞型中的表達情況

PD-1及其配體分子PD-L1和PD-L2在POLE/MSI亞型中表達顯著高于TP53/NSMP亞型(P<0.01，圖2)。PD-1/PD-L1/PD-L2表達在POLE與MSI兩種亞型之間差異無統(tǒng)計學意義。類似地，CTLA-4(P<0.001)及配體CD80的表達(P=0.006)在POLE/MSI兩種亞型中的表達高于另外兩種亞型。不過，CTLA- 4的另一個配體CD86(P=0.062)在四種亞型中無明顯變化。雖然TIM- 3在POLE/MSI亞型中表達高于NSMP/TP53亞型(P=0.006)，但其配體Gal- 9在四種亞型中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.096)。POLE/MSI亞型中LAG- 3表達較NSMP/TP53亞型升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。作為LAG- 3的配體，F(xiàn)GL1分子則主要在MSI及NSMP兩種亞型中高表達(圖2)。

圖2 四種分子亞型中不同免疫檢查點分子的表達分析

Figure 2. Expression of Diverse Immune Checkpoint Molecules in Four Molecular Subtypes of EC

Expressionofreceptors/ligands(PD-1/PD-L1/PD-L2,CTLA-4/CD80/CD86,TIM-3/Gal-9,LAG-3/FGL1)infourmolecularsubtypeswasanalyzed,anddifferenceingeneexpressionamonggroupswascomparedbyt-test.

2.3 免疫檢查點分子與EC患者預后的關系

在各種免疫檢查點受體分子中，CTLA-4和PD-1高表達的患者OS顯著延長(P<0.05，圖3A)。TIM-3和LAG-3高表達組OS也有延長趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在相應配體分子中，CD80、PD-L1、Gal-9表達均與OS無顯著相關。但是，F(xiàn)GL1高表達組的OS較低表達組更好，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007，圖3A)。多數(shù)免疫檢查點分子(包括CTLA-4/CD80、PD-1/PD-L1、TIM-3/Gal-9和LAG-3)與RFS并無顯著相關(P>0.05，圖3B)。然而，F(xiàn)GL1高表達與RFS延長顯著相關(P<0.001，圖3B)。

2.4 LAG- 3/FGL1通路是EC潛在的免疫治療靶點

進一步分析LAG-3/FGL1基因表達與病理類型的關系，發(fā)現(xiàn)LAG-3在子宮內膜樣癌(endometrioid)、混合型癌(mixed)、漿液性癌(serous)中的表達差異無統(tǒng)計學意義(圖4A)。FGL1在子宮內膜樣癌中的表達顯著高于另外兩種病理學類型(P<0.001，圖4A)。生存分析表明，在子宮內膜樣癌中，F(xiàn)GL1高表達與RFS延長顯著相關(P=0.012，圖4B)。FGL1高表達組與低表達組相比OS有延長趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.140，圖4B)。在漿液性/混合型癌中，F(xiàn)GL1表達與OS或RFS的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4B)。

圖3 各種免疫檢查點分子與EC患者預后的相關性分析。根據(jù)每個基因的表達值，按中位值作為閾值將患者分為高(High)、低(Low)表達兩組。采用Kaplan- Meier法繪制兩組患者的生存曲線，用log- rank檢驗計算統(tǒng)計顯著性。

Figure 3. Correlation between Expression of Immune Checkpoint Molecules and Prognosis of EC Patients

Accordingtotheexpressionvalueofeachgene,patientsweredividedintohigh-andlow-expressiongroupsusingmedianasthethreshold.Kaplan-Meiercurvesoftwogroupswerecomparedbylog-ranktest.(A)AnalysisforOS.(B)AnalysisforRFS.

通過分析LAG-3/FGL1表達與腫瘤微環(huán)境中浸潤淋巴細胞的關系，發(fā)現(xiàn)LAG-3與CD8+T淋巴細胞成分顯著相關(r>0.75，圖4C)，而FGL1與CD8+T淋巴細胞無明顯相關性(r<0.1，圖4C)。同樣，F(xiàn)GL1與Treg細胞、巨噬細胞等免疫負調控細胞也無明顯相關性(r<0.1，圖4C)。我們推測FGL1主要表達于癌細胞，因此比較了癌組織與23例正常對照組織中FGL1的表達。與正常組織相比，子宮內膜樣癌組織中FGL1表達顯著升高(P<0.001，圖4D)。而漿液性/混合型癌組織與正常組織相比，F(xiàn)GL1表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.300，圖4D)。此外，F(xiàn)GL1高表達的腫瘤組織中，腫瘤突變負荷顯著升高(P=0.020，圖4E)。

圖4LAG-3/FGL1免疫檢查點通路分析

Figure4.Analysis ofLAG-3/FGL1Immune Checkpoint Pathway

A.ExpressionofLAG-3andFGL1inendometrioid,mixedandserouscarcinomas.Comparisonbetweengroupswasconductedbyt-test;ns=notsignificant;***=P<0.001.B.SubgroupanalysisofrelationshipbetweenFGL1andprognosis.CorrelationbetweenFGL1expressionandOSinendometrioidcarcinoma,thatbetweenFGL1expressionandRFSinendometrioidcarcinoma,thatbetweenFGL1expressionandOSinserous/mixedcarcinoma,andthatbetweenFGL1expressionandRFSinserous/mixedcarcinomawereanalyzed,respectively.Pvaluewascalculatedbylog-ranktest.C.Pearsoncorrelation(riscorrelationcoefficient)betweenLAG-3/FGL1andtheinfiltrationabundanceofvariousimmunecells.D.ExpressionofFGL1innormaltissue,endometrioidcarcinomasandserous/mixedcarcinomasweredifferent.t-testwasusedtocomparethedifferencebetweengroups.E.RelationshipbetweenFGL1expressionandTMB.PatientsweredividedintotwogroupsaccordingtothemedianvalueofFGL1expression.DifferenceofTMBbetweengroupswascalculatedbyMann-Whitneytest.

3 討 論

近年來，免疫治療在抗腫瘤領域取得巨大進展。其中，免疫檢查點抑制劑如Ipilimumab(靶向CTLA-4)、Nivolumab和Pembrolizumab(靶向PD-1)已經獲批用于臨床治療，靶向LAG-3的抑制劑也已開展臨床試驗。針對晚期/復發(fā)性EC，雖然目前尚無大規(guī)模隨機對照臨床試驗結果，但多項小樣本試驗、個案報道提示免疫治療有巨大潛力。比如，PD- 1抗體Pembrolizumab治療MMR基因缺陷型復發(fā)性EC，總反應率和疾病控制率分別為55%和89%[23]。另一項研究報道了2例多次復發(fā)、難治性EC患者，應用PD- 1抑制劑Nivolumab進行治療，治療反應良好[16]。然而，臨床試驗KEY- Note 028納入了24例PD- L1表達評分大于1的、MSI- H型EC患者，經Pembrolizumab治療后，總有效率僅為12.5%[24]。這些結果表明，雖然免疫治療能讓部分EC患者獲益，如何篩選獲益患者、以及藥物選擇仍有待進一步研究。

EC的四種分子亞型與免疫檢查點抑制劑治療反應有潛在關聯(lián)。POLE突變型和MSI型腫瘤具有廣泛的基因突變，TMB更高。研究表明，在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中高TMB與PD- 1/PD- L1抑制劑獲益顯著相關[12- 13]?？赡苁且驗楦逿MB的腫瘤有機會產生更多腫瘤新抗原，由此刺激抗腫瘤免疫應答反應。文獻還報道，POLE突變型EC組織中浸潤T細胞和CD8+T細胞數(shù)目，以及PD-1表達顯著升高[14]。本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中更新后的521例EC患者進行再分析，同樣證實POLE突變型和MSI型的腫瘤中總白細胞、T細胞以及CD8+T細胞浸潤程度顯著升高。這與TCGA樣本的HE染色一致，其結果顯示POLE突變型腫瘤中淋巴細胞浸潤最豐富，而MSI型的浸潤程度介于POLE突變型和微衛(wèi)星穩(wěn)定型之間[15]。本研究也再次證實POLE突變型和MSI型EC中PD-1和PD-L1的表達明顯高于另外兩種亞型。Eggink等[25]通過免疫組化的方法也同樣證明該現(xiàn)象。TIM-3作為免疫檢查點分子，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮作用，可作為潛在的腫瘤免疫治療靶點[26]。本研究雖然發(fā)現(xiàn)TIM-3在POLE/MSI型EC中高表達，但其配體Gal-9在四種分子亞型中表達差異無統(tǒng)計學意義，與預后的相關性也無統(tǒng)計學意義。因此，靶向TIM-3/Gal-9通路在EC中的意義尚需進一步研究。此外，我們發(fā)現(xiàn)免疫抑制分子CTLA-4/CD80在POLE突變型和MSI型中的表達顯著高于TP53突變型及NSMP亞型。因此，抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治療在POLE突變型和MSI型中的應用均值得進一步深入研究。

LAG-3是活化T細胞表面的另一個免疫抑制性受體。LAG-3在腫瘤浸潤淋巴細胞表面中表達上調，而阻斷LAG-3可以提高抗腫瘤T細胞反應[27- 28]。此外，同時阻斷LAG-3和PD-1兩條通路比單獨阻斷任何一條通路具有更好的抗腫瘤效應，提示LAG-3與PD-1在腫瘤免疫逃逸機制中起協(xié)同作用[9, 27- 28]。因此LAG-3是一個重要的免疫治療靶點，目前已經在血液腫瘤(NCT02061761)和實體腫瘤(NCT01968109)中開展相關臨床試驗。本研究發(fā)現(xiàn)LAG-3在EC的四種分子亞型中的表達趨勢與PD-1、CTLA-4相似，提示抗LAG-3可能作為EC治療靶點。FGL1最近剛被鑒定為LAG-3的配體，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1在EC中的表達趨勢與其他免疫抑制分子有一定差別。比如FGL1在POLE突變亞型中表達并不高，而在MSI中表達升高。此外，F(xiàn)GL1在NSMP中表達也異常升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1的表達與T細胞、Treg細胞、巨噬細胞等間質細胞成分均無相關性，而在子宮內膜樣癌中顯著高于正常對照組織。這與文獻報道一致，F(xiàn)GL1在NSCLC中主要表達于癌細胞，而腫瘤間質表達較低[9]。在NSCLC組織中，F(xiàn)GL1高表達與患者不良預后顯著相關[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內膜樣癌中，F(xiàn)GL1高表達的患者RFS較好，而在漿液性或混合型癌中FGL1表達與患者預后的關系無統(tǒng)計學意義。這表明，LAG-3/FGL1通路調控較為復雜，在不同癌種、不同病理學類型中可能有不同機制?？傊琇AG-3/FGL1通路在EC中異常表達，提示該通路可作為EC免疫治療的另一個候選靶點，為后續(xù)基礎研究和臨床研究提供了思路。

綜上所述，抗PD-1/PD-L1治療EC在小樣本試驗中已經顯示出較好的治療反應和臨床獲益。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中較大樣本的EC基因數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PD-1、CTLA-4和LAG-3分子在POLE突變型和MSI型EC中表達升高。特別是LAG-3/FGL1通路的表達特征具有重要臨床意義。因此，單獨靶向其中任意一條通路或聯(lián)合阻斷多條通路，均可作為EC免疫治療的候選策略。

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利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

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