通用型NF-κB熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞系的構(gòu)建

鄭海亮 王東方 方雅 刁小偉 文勇，2 袁云霞，2

（1. 江蘇奧賽康生物醫(yī)藥有限公司，南京 211112；2. 江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，南京 211112）

核因子 -κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）是由Sen和Baltimor首次從B淋巴細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白因子，能夠與免疫球蛋白κ輕鏈的κB序列相結(jié)合［1］。NF-κB蛋白家族包括5個(gè)亞基：NF-κB1（P50）、NF-κB2（P52）、RelA（P65）、Rel（c-REL）和RelB，這些亞基能夠形成同源或異源二聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，其中以P50-P60形式最為常見。這些二聚體通常與抑制因子IκB（Inhibitor of NF-κB）結(jié)合，形成復(fù)合物，處于非激活狀態(tài)。當(dāng)受到刺激因素如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 病 毒、 氧 自 由 基、 脂 多 糖（Lipopolysaccharides，LPS）等刺激時(shí)，復(fù)合物被激活，解離出NF-κB并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中與相應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄［2］。此外，NF-κB參與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）［3］、表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）［3］、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（Nerve growth factor receptor，NGFR）［4］、 白 介 素 -1 受 體（Interleukin-1 receptor，IL-1R）［5-6］、CD40［7］等 受體或受體家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是眾多信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，能夠與多種細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子相結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、炎癥和凋亡等過程。

報(bào)告基因（Reporter gene）是指編碼易于被檢測(cè)的酶或蛋白的基因，通常插入到表達(dá)調(diào)節(jié)序列當(dāng)中，或與目的基因相連接形成嵌合序列。由于報(bào)告基因法作用迅速，往往只需要幾個(gè)小時(shí)即可獲取到檢測(cè)結(jié)果，在體外藥物篩選中可實(shí)現(xiàn)高通量操作，因此備受關(guān)注［8］。常用的報(bào)告基因包括熒光素酶（Luciferase）、熒光蛋白和β-半乳糖苷酶等。熒光素酶是指來源于自然界能夠發(fā)光的生物體內(nèi)，可以催化熒光素氧化發(fā)光的一類酶的總稱，具有非放射性、靈敏度高、反應(yīng)迅速、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。截至目前，應(yīng)用最為廣泛的是來自于螢火蟲和發(fā)光海腎的熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是一個(gè)單亞基蛋白，穩(wěn)定性好且不需要進(jìn)行翻譯后修飾，可用于報(bào)告基因系統(tǒng)［9］。

在本研究中，構(gòu)建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細(xì)胞系，由于NF-κB涉及細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此可用于NF-κB激活相關(guān)的藥物活性檢測(cè)，可進(jìn)行改造和應(yīng)用。本研究中以FGFRⅡ?yàn)槔?，?duì)其擴(kuò)展應(yīng)用進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

Plentivirus-NF-κB-RE-Luc2P， 購 買 于 QIAGEN公司；Plentivirus-FGFRⅡ，購買于Cyagen公司；HEK293細(xì)胞，購買于中科院細(xì)胞庫；TNF-α，購自R&D公 司；生 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 基，DMEM（GIBCO）+10%FBS（GIBCO）+1%青鏈雙抗（GIBCO），工作培養(yǎng)基，DMEM+1%FBS；選擇培養(yǎng)基：生長(zhǎng)培養(yǎng)基+2 μg/mL Puromycin（GIBCO），生長(zhǎng)培養(yǎng)基 +2 μg/mL Puromycin+300μg/ml Hygromycin（GIBCO）；SURE-entry，熒光素酶顯色劑（One-Glo），購自 Promega公司；RNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBRGREEN I matrix，購自Takara公司；Palifermin?購自Amgen公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細(xì)胞培養(yǎng) 病毒感染前1 d，采用0.25%胰酶消化，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以1.6×104/mL細(xì)胞濃度接種24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)目為8×104/孔，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.2.2 病毒感染HEK293細(xì)胞 根據(jù)病毒感染使用說明，取一支病毒懸液于4℃ 解凍。移除24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，依次緩慢加入相應(yīng)體積10%FBS+DMEM 培養(yǎng)基，完全解凍的病毒懸液，感染輔助試劑SURE-entry（終濃度=8 μg/mL），輕輕搖勻，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置6-8 h，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，繼續(xù)培養(yǎng)72-96 h。

1.2.3 加壓篩選及單克隆細(xì)胞株分離培養(yǎng) 培養(yǎng)72-96 h后，更換為選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，間隔每2-3 d換液，篩選時(shí)間約2-3周，細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)至75 cm2細(xì)胞瓶，凍存多克隆細(xì)胞系。多克隆細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后進(jìn)行單克隆篩選，以5/mL細(xì)胞濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)目為0.5個(gè)，24 h后鏡下觀察，挑選只含有單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞孔，間隔3-4 d換液，篩選時(shí)間約3周，細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí)消化細(xì)胞并逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)至75 cm2細(xì)胞瓶，凍存單克隆細(xì)胞系。

1.2.4 RT-QPCR 取 1×106個(gè) FGFR Ⅱ /NF-κB-RELuc2P HEK293細(xì)胞提取RNA并測(cè)定RNA濃度。RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，反應(yīng)體系為 1 μg RNA，4 μL 5× prime script buffer，1 μL Oligo DT primer，1 μL Oligo DT primer Random 6mers，補(bǔ) H2O 至 20 μL。QPCR 反 應(yīng) 體 系 為 12.5 μL SYBRGREEN I matrix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5 μL cDNA，補(bǔ)H2O至25 μL。引物序列：目的基因FGFRⅡ-F/R，CTCAAGCACTCGGGGATAAA/ CTGTTTTGGCAGGA-CAGTGA；內(nèi)參基因Beta-actin-F/R，CATCGAGCACGGCATCGTCA/ TAGCACAGCCTGGATAGCAAC。反應(yīng)程序?yàn)?95℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；60℃，15 s，70℃，10 s。2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞系熒光素酶活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NF-κB-RE-Luc2P HEK293 或 FGFR Ⅱ /NF-κB-RELuc2P HEK293細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，用工作培養(yǎng)基1%FBS+DMEM 稀釋至 4×105個(gè) /mL，轉(zhuǎn)移 100 μL到96孔板中，細(xì)胞數(shù)目4×104個(gè)/孔，過夜培養(yǎng)。TNF-α刺激 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基2倍梯度稀釋TNF-α（100 ng/mL，共12個(gè)濃度梯度，每孔100 μL加入96孔板中；FGF融合蛋白刺激FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞，工作培養(yǎng)基4倍梯度稀釋FGF融合蛋白（50 ng/mL），共10個(gè)濃度梯度，每孔100 μL加入96孔板中；37℃、5%CO2孵育6 h后，每孔加入One-Glo 50 μL，室溫反應(yīng)5 min，放入酶標(biāo)儀讀數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用四參數(shù)擬合。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或3次以上，所獲得的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式進(jìn)行表示，數(shù)據(jù)均采用Graph-pad Prism5軟件進(jìn)行分析，不同數(shù)據(jù)間對(duì)比采用t檢驗(yàn)法，當(dāng)P＜0.05時(shí)差異顯著（*），當(dāng)P＜0.01時(shí)差異極顯著（**表示P＜0.01，***表示P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 病毒最佳感染效率（MOI）確定

在NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染HEK293實(shí)驗(yàn)中，MOI分別設(shè)置了0、5、10、15和20等5個(gè)梯度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1-A）表明，MOI為10-20時(shí)轉(zhuǎn)染效果較好，其中又以MOI=15轉(zhuǎn)染效率最高。當(dāng)MOI=15時(shí)，用NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染細(xì)胞，所獲得的多克隆細(xì)胞接種于96孔板中，進(jìn)行功能驗(yàn)證。加入20 ng/mL TNF-α刺激6 h后，采用One-Glo化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，信噪比可達(dá)到20.2倍（P=0.007 3）（圖 1-B），結(jié)果表明 NF-κB-RE-Luc2P慢病毒已成功感染HEK293細(xì)胞。

2.2 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系單克隆篩選及驗(yàn)證

為了進(jìn)一步得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，多克隆細(xì)胞NF-κB-RE-Luc2P HEK293采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆分離培養(yǎng)，使用Puromycin加壓篩選。經(jīng)過加壓與分離培養(yǎng)，成功地獲得了NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。將獲取的單克隆細(xì)胞鋪到96孔板，進(jìn)行功能驗(yàn)證。TNF-α（100 ng/mL起始，2倍梯度稀釋）刺激6 h，采用One-Glo化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示（圖2-A），響應(yīng)值與TNF-α濃度可擬合成劑量依賴的“S”型曲線，當(dāng)TNF-α濃度為20 ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比，信噪比可達(dá)到113.7倍以上（P＜0.001）（圖2-B）。結(jié)果表明，本研究成功獲得NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細(xì)胞系。

圖1 MOI及病毒感染驗(yàn)證

2.3 NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系應(yīng)用實(shí)例

為了證明NF-κB-RE-Luc2P HEK293單克隆細(xì)胞系改造后可用于藥物活性檢測(cè)，將此細(xì)胞系感染FGFRⅡ受體，按照同樣的單克隆篩選流程，使用Puromycin和Hygromycin加壓培養(yǎng)，獲得單克隆細(xì)胞 FGFR Ⅱ /NF-κB-RE-Luc2P HEK293。RT-QPCR檢測(cè)FGFRⅡ mRNA表達(dá)水平，其表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，比值可達(dá)到204倍（204.2∶1）（圖3-A），結(jié)果表明，F(xiàn)GFRⅡ成功導(dǎo)入到NF-κB-RELuc2P HEK293，并可穩(wěn)定表達(dá)。

為了進(jìn)步驗(yàn)證此細(xì)胞系的藥物檢測(cè)功能，選用FGF7類蛋白藥物Palifermin?，梯度稀釋后加入到此細(xì)胞系中，結(jié)果（圖3-B）顯示，響應(yīng)值與Palifermin?濃度呈劑量依賴型S曲線，表明該細(xì)胞系可用于FGF7蛋白藥物活性檢測(cè)。

圖2 NF-κB-RE-luc2P HEK293細(xì)胞系TNF-α刺激實(shí)驗(yàn)

圖3 FGFR II/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系鑒定

3 討論

隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展與檢測(cè)手段的不斷革新，熒光素酶報(bào)告基因法憑借其靈敏度高、簡(jiǎn)便可靠等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)越來越受業(yè)內(nèi)關(guān)注，已逐漸成為藥物篩選及體外活性檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。然而，針對(duì)不同生物靶點(diǎn)的藥物篩選及藥物活性檢測(cè)，往往需要對(duì)其適配的工程細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)構(gòu)建或定制，人力、物力及時(shí)間成本投入較大。因此，在一定程度上具備通用性的細(xì)胞系就顯得尤為必要。

NF-κB信號(hào)通路與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)及分化緊密相關(guān)，以NF-κB及其信號(hào)通路為靶標(biāo)的藥物可用于腫瘤和炎癥的預(yù)防與治療。如NF-κB特異性抑制劑藥物（Dehydroxymethylepoxyquinomicin，DHMEQ），在肺癌［10］、肝癌［11］、乳腺癌［12］和多發(fā)性骨髓瘤［13］的體內(nèi)外研究中均取得了理想的研究結(jié)果，又如地塞米松、阿司匹林和舒林酸等抗炎藥物，也是通過阻斷NF-κB通路發(fā)揮其抗炎效果［14］。除此之外，NF-κB還廣泛參與TNFR、FGFR、EGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受體或受體家族的調(diào)節(jié)過程，是眾多信號(hào)通路的交匯點(diǎn)［15-16］，因此該細(xì)胞系在這類靶點(diǎn)相關(guān)藥物的篩選及檢測(cè)中，具備通用性。

細(xì)胞系構(gòu)建及篩選是一個(gè)復(fù)雜而又繁瑣的實(shí)驗(yàn)過程。在本研究中，以慢病毒為載體，攜帶目的基因進(jìn)行感染HEK293，由于病毒感染的過程對(duì)細(xì)胞具有一定損傷作用，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)必須保證HEK293維持在較好的細(xì)胞狀態(tài)，如待用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)熱、病毒及SURE-entry的添加必須輕柔避免細(xì)胞脫落等。在單克隆篩選實(shí)驗(yàn)中，本研究采用的是有限稀釋法進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此在克隆挑選時(shí)必須在細(xì)胞發(fā)生分裂前進(jìn)行，此時(shí)細(xì)胞孔內(nèi)僅有單個(gè)細(xì)胞，從而可以保證所獲得的細(xì)胞系均為單一克隆。

在本研究中，以NF-κB-RE-Luc2P慢病毒為載體，經(jīng)感染、抗生素加壓與單克隆分離培養(yǎng)成功獲得了NF-κB-RE-Luc2P單克隆細(xì)胞系，該細(xì)胞系可直接用于以TNF-α或其受體家族為靶點(diǎn)的藥物篩選及活性檢測(cè)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶向治療藥物Humira?及其生物類似藥等［17］。同時(shí)本研究還奠定了以NF-κBRE-Luc2P HEK293細(xì)胞系為基礎(chǔ)，針對(duì)不同的研究需求繼續(xù)進(jìn)行改造和完善的方案，繼續(xù)引入EGFR、FGFR、NGFR等受體，可用于后續(xù)的相關(guān)藥物活性檢測(cè)。如本研究成功導(dǎo)入了受體FGFRⅡ，獲得了FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系，進(jìn)行了體外FGF類藥物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該細(xì)胞系可用于FGF類藥物的活性檢測(cè)。

4 結(jié)論

在本研究中，采用慢病毒感染方法成功構(gòu)建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系，該細(xì)胞系可直接用于以TNF-α或其受體家族為靶點(diǎn)的藥物篩選及活性檢測(cè)。同時(shí)，由于NF-κB還涉及EGFR、FGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受體或受體家族介導(dǎo)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以此細(xì)胞系為基礎(chǔ)感染FGFR家族的受體FGFRⅡ，并進(jìn)行了初步確證，結(jié)果表明響應(yīng)值與藥物Palifermin?呈現(xiàn)濃度依賴型“S”型曲線，可用于該類藥物活性檢測(cè)。綜上所述，本研究成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)的NF-κB-RE-Luc2P HEK293細(xì)胞系。由于NF-κB是細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，因此該細(xì)胞系具備通用性及進(jìn)一步改造的潛力，具有研究及應(yīng)用價(jià)值。