解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌物質(zhì)分離及對灰葡萄孢抑菌作用研究

劉超 劉洪偉 汪步青 趙雯雅 王雅娜 張麗萍

（1. 河北工業(yè)大學(xué)，天津 300000；2. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；3. 河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081）

芽孢桿菌（Bacillus）由于能產(chǎn)生多種胞外生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)及工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［1］。產(chǎn)生的胞外抑菌活性物質(zhì)可分為由核糖體途徑合成的抑菌物質(zhì)：細(xì)菌素、抗菌蛋白、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和由非核糖體途徑合成的抑菌物質(zhì)：表面活性素、伊枯草素、芬薺素、聚酮類化合物等［2］。其中，細(xì)菌素及表面活性素、伊枯草素、芬薺素及抗菌蛋白類物質(zhì)的研究較多［3］。從解淀粉芽孢桿菌FZB42中分離的環(huán)狀細(xì)菌素（Amylocyclicin）對革蘭氏陽性細(xì)菌有較好抑制作用［4］；解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM 產(chǎn)生的細(xì)菌素（PPB），能抑制李斯特氏菌、沙門氏菌和志賀氏桿菌。楊瑞先等［5］分離到兩株解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33對牡丹病原菌有良好抑制效果，所產(chǎn)脂肽類粗提物也具有較強的體外抑菌活性。郭繼平等［6］篩選到的一株解淀粉芽孢桿菌生防菌能分泌多種抗菌蛋白并對葡萄霜霉病有抑制作用。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、功能特性及應(yīng)用研究，集中在多種抑菌活性物質(zhì)，對單一物質(zhì)的研究缺乏。

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的不同抑菌活性物質(zhì)其抑菌作用機制不同。細(xì)菌素可影響細(xì)胞膜的滲透壓［7］，幾丁質(zhì)酶可降解真菌的細(xì)胞壁［7］，β-1，3-葡聚糖酶通過水解β-1，3-糖苷鍵破壞真菌細(xì)胞壁［8］。表面活性素能改變細(xì)胞膜通透性使細(xì)胞內(nèi)離子流出［9］，伊枯草素能使真菌菌絲分解和抑制孢子萌發(fā)［10］，芬薺素有良好的脂溶性能與細(xì)胞膜磷脂層反應(yīng)［11］等。潘虹余等［12］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌 B15 產(chǎn)生的伊枯草素A和芬薺素以協(xié)同作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形式來抑制灰葡萄孢菌絲的生長。但不同抗菌物質(zhì)對灰葡萄孢的作用效果和作用機制有待進(jìn)一步研究。

本實驗室在前期篩選到一株解淀粉芽孢桿菌BA-26其代謝產(chǎn)物抑菌活性強，研究表明具有酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性［13］。本研究分離純化了菌株BA-26胞外抑菌物質(zhì)并將初步分離的粗提物及純化后的抗菌物質(zhì)對灰葡萄孢進(jìn)行抑菌作用研究。了解此菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)存在情況和抑菌作用機制，為其進(jìn)一步應(yīng)用尤其在防治植物病原真菌病害方面的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）BA-26、番茄灰霉病菌（B. cinerea）來自于河北省科學(xué)院生物研究所微生物研究室。

1.1.2 主要試劑和儀器 Amberlity XAD-7HP大孔樹脂，美國Sigma公司；乙腈、甲醇和三氟乙酸為美國Fisher Chemical色譜純試劑；LC-20A HPLC系統(tǒng)，日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株BA-26胞外抗菌物質(zhì)的分離純化

1.2.1.1 硫酸銨鹽析 采用硫酸銨沉淀法制備抗菌粗提物。取菌株BA-26培養(yǎng)48 h的無菌發(fā)酵液2 L，加入硫酸銨固體使飽和度達(dá)到60%，4℃靜置12 h，然后8 000 r/min離心30 min，收集沉淀和上清液，取沉淀溶于5 mL無菌水，檢測抑菌效果。此沉淀即為抗菌粗提物（Antibacterial crude extract，A）。

1.2.1.2 大孔樹脂吸附法 取由2 L發(fā)酵液所得的抗菌粗提物，以 600 mL的無菌水溶解，加入20-60目大孔樹脂200 g，4℃下?lián)u勻12 h。樹脂經(jīng)過濾收集后，用蒸餾水洗滌3次，再分別用200 mL 10%、20%、30%……100%乙醇（V/V）依次洗滌［14］。收集各組分洗脫液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中42℃減壓蒸干。收集蒸干組分分別溶于5 mL無菌水于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 高效液相色譜法 采用SHIMADZU LC-20A高效液相色譜分析進(jìn)一步純化［15］。流動相A為含0.1%（V/V）三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.1%（V/V）三氟乙酸的超純水。將大孔樹脂分離樣品加載到WondaSil C18 4.6 mm×150 mm、粒徑5 μm色譜柱中，以10%-90%乙腈為線性梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為214 nm。收集各保留時間所對應(yīng)的組分，經(jīng)氮吹濃縮，冷凍干燥后稱重，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗菌物質(zhì)的抑菌活性測定

為了孕育你，數(shù)月忍受膽汁俱下的嘔吐之苦；為了你的降臨，忍受人間最慘烈的裂骨之痛；你的一個小翻身，她都會醒來呵護(hù)，數(shù)年沒睡過一晚安穩(wěn)覺；你第一次抬頭，第一次爬行，坐起站立學(xué)步，甚至怎樣拿筷子……點滴成長都伴隨著她的心血……你總認(rèn)為你現(xiàn)在是最難的。其實，世上最難的職業(yè)，叫做媽媽。

1.2.2.1 對病原真菌活性測定 采用平板對峙法，將50 mL病原真菌孢子懸液（1×106CFU/mL）與300 mL 融化的PDA培養(yǎng)基混合均勻后，倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后，均勻打孔直徑為8 mm。每孔加100 μL待測物質(zhì)，于26± 1℃下培養(yǎng)2-4 d，觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生并測量抑菌圈直徑大小。每個處理重復(fù)3次。

1.2.2.2 對細(xì)菌活性測定 于平板上挑取細(xì)菌單菌落，接種至裝有30 mL LB培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，37℃，180 r/min培養(yǎng)14 h。采用平板傾注法［16］，將細(xì)菌菌液與LB固體培養(yǎng)基混合均勻，在含菌平板上均勻打孔直徑為8 mm。每孔加100 μL待測物質(zhì)，37℃培養(yǎng)20 h，測量抑菌圈直徑大小。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 BA-26活性組分對灰葡萄孢菌絲的影響 挑取灰葡萄孢菌絲于載玻片上，用無菌生理鹽水沖洗后，用超純水溶解濃度為1 mg/mL的活性組分處理灰葡萄孢菌絲6 h，無菌生理鹽水沖洗后用0.04%臺盼藍(lán)染色30 min，置于顯微鏡下觀察。以未經(jīng)處理的菌絲為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 BA-26活性組分對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響 采用凹玻片懸滴法制片觀察。分別取少量BA-26活性組分，用超純水溶解制成1 mg/mL的溶液。各取50 μL無菌活性組分溶液與50 μL液體PDA 培養(yǎng)基混合，再與100 μL灰霉孢子懸液（1×106CFU/mL）混合后于無菌凹玻片上26 ± 1℃培養(yǎng)，每6 h后使用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況。以未經(jīng)處理的孢子為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.2.5 BA-26活性組分的最小抑菌濃度測定 采用二倍稀釋法［17］配制濃度為 3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00和 1000.00μg/mL的抗菌物質(zhì)組分，各取100 μL加入瓊脂孔中。置于26 ± 1℃培養(yǎng)2 d后，分別測量抑制區(qū)半徑來確定對菌絲體的抑制效果。以70%的乙腈水溶液為對照，每處理組分重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗，不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 菌株BA-26抗菌物質(zhì)分離純化及抗菌粗提物的抑菌譜

2.1.1 硫酸銨鹽析 對菌株BA-26無菌發(fā)酵液，進(jìn)行硫酸銨鹽析。以番茄灰霉病菌為指示菌，硫酸銨鹽析后上清液和無菌水為對照，檢測抑菌活性。研究結(jié)果（圖1）表明，不同飽和度的硫酸銨鹽析時，沉淀和上清液的抑菌活性不同，在硫酸銨飽和度為60%時獲得沉淀抗真菌活性最強，并且上清液沒有抑菌活性。為達(dá)到將盡可能多的活性物質(zhì)沉淀的效果，選擇飽和度為60%作為制備抗菌粗提物的最佳硫酸銨濃度。

2.1.2 菌株BA-26抗菌粗提物的抑菌譜 飽和度為60%硫酸銨沉淀獲得抗菌粗提物檢測結(jié)果（表1）顯示：菌株BA-26抗菌粗提物對所試12種真菌都有十分明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均在15.7 mm以上。其中接骨木鐮刀菌、番茄早疫病菌、立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、蘋果輪紋病菌、三七病原菌、米曲霉菌的抑制作用很強，抑菌圈直徑分別達(dá)到34.7、36.3、40.0、30.3、30.7、39.3和30.4 mm；而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有抑菌作用。菌株BA-26抗菌粗提物中的抑菌物質(zhì)主要為抗真菌物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)抑菌譜廣。

圖1 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物活性檢測

2.1.3 大孔樹脂分離結(jié)果分析 硫酸銨沉淀獲得的抗菌粗提物經(jīng)大孔樹脂吸附分離，除未吸附的組分外，共得到了10個組分，即A1-A10。由表2可知，不同分離組分表現(xiàn)出不同的抑菌活性，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液洗滌后的組分A6的抗真菌效果最好。比較每一級組分抑菌活性大小，發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)集中出現(xiàn)在中間這些級分，說明存在的抑菌活性物質(zhì)可能兼有親水性和親脂性的特點。選擇抑菌活性最強的A6組分進(jìn)一步分離純化。

2.1.4 反相高效液相色譜法分離純化結(jié)果分析 采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進(jìn)一步純化結(jié)果見圖2?；钚晕镔|(zhì)A6 組分在不同波長下進(jìn)行檢測，在214 nm 處有較大吸收峰，所以選擇檢測波長為214 nm。菌株BA-26活性組分A6中至少有34類組分，即A6-1-A6-34。它們中大部分都不是單一峰，表明它們不是單一物質(zhì)。這與芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)中可能存在很多結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體和同系物，很難分離到單一物質(zhì)的特征相符。將這34類組分冷凍干燥后用70%乙腈水溶液溶解進(jìn)行抑菌活性追蹤。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)保留時間為29 min時的A6-15組分和保留時間為34-43min時的A6-19-A6-28各組分具有抗真菌活性。

表1 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物對不同病原真菌的抑菌直徑

表2 解淀粉芽孢桿菌BA-26抗菌粗提物分離組分對番茄灰霉病菌的抑菌圈直徑

圖2 菌株BA-26抗菌粗提物分離組分A6的反相高效液相色譜圖及活性峰檢測

2.1.5 活性組分對灰葡萄孢的抑菌作用 將經(jīng)RPHPLC分離的活性組分，配制成濃度為1 mg/mL的溶液并檢測抑菌活性。由圖3可知，不同組分的抗菌物質(zhì)對灰葡萄孢抑菌作用不同，其中A6-19組分抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)27.4 mm，A6-20組分的抑菌圈直徑為27.1 mm與之相比無顯著差異；A6-21組分抑菌圈直徑為24.8 mm強于A6-22、A6-27和A6-28這些相互之間抑菌效果無差異組分；A6-22、A6-23、A6-24、A6-25組分的抑菌效果無顯著差異，它們的抑菌圈直徑分別為23.3、23.2、22.8和22.7 mm；A6-26組分抑菌效果相對較弱抑菌圈直徑為21.0 mm；A6-15組分抑菌效果低于所有組分抑菌圈直徑為17.9 mm。說明菌株BA-26的主要抗菌物質(zhì)存在于A6-19-A6-28這些組分。

2.2 菌株BA-26胞外活性物質(zhì)對灰葡萄孢抑菌作用研究

2.2.1 活性組分對灰葡萄孢菌絲形態(tài)的影響 如圖4中所見，經(jīng)抗菌物質(zhì)處理培養(yǎng)6 h后觀察，未經(jīng)抗菌物質(zhì)處理的灰葡萄孢菌絲形態(tài)飽滿，表面光滑，正常生長并向四周擴展，在分生孢子梗末端觀察到孢子的產(chǎn)生（圖4-A）。A6-15組分處理的菌絲，菌絲形態(tài)變化不明顯，與對照相比菌絲結(jié)構(gòu)完整，僅能觀察到菌絲明顯彎曲，未出現(xiàn)膨大變粗，也未觀察到菌絲內(nèi)容物外流（圖4-B）。而A6-19-A6-28這些組分在其抗菌物質(zhì)的作用下菌絲形態(tài)變化明顯，表現(xiàn)出相似的特征，菌絲細(xì)胞畸形，菌絲體彎曲變粗，中部腫脹，頂端膨大，分枝菌絲生長受阻（圖 4-C，4-D）。

2.2.2 活性組分處理灰葡萄孢菌絲后臺盼藍(lán)染色臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示：未經(jīng)處理的菌絲形態(tài)正常未被染色（圖5-A）；A6-15組分處理的灰葡萄孢菌絲未被染色（圖5-B）；A6-19-A6-28這些組分處理的灰葡萄孢菌絲生長受阻，有明顯的膨大，部分菌絲出現(xiàn)較大的囊泡部分，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，鏡檢時發(fā)現(xiàn)菌絲呈現(xiàn)藍(lán)色（圖5-C）。說明A6-19-A6-28這些組分抗菌物質(zhì)的作用機制可能與破壞灰葡萄孢菌絲的細(xì)胞膜有關(guān)。

圖4 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢菌絲形態(tài)的影響

圖5 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分處理灰葡萄孢菌絲臺盼藍(lán)染色

2.2.3 活性組分的最小抑菌濃度 測定A6-15和A6-19-A6-28各組分對灰葡萄孢的MIC，結(jié)果如表3所示。A6-19-A6-28這些組分對灰葡萄孢的抗菌作用高于A6-15組分。其中，A6-19和A6-20組分對灰葡萄孢的抗菌活性最強，最小抑菌濃度為7.81 μg/mL。

表3 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢的MIC值

2.2.4 活性組分對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響 經(jīng)活性物質(zhì)處理的灰葡萄孢孢子培養(yǎng)36 h后觀察其萌發(fā)抑制情況。由圖6可知，未經(jīng)處理的孢子萌發(fā)明顯，長出相當(dāng)于孢子徑6-10倍的菌絲（圖6-A）；A6-15組分對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用最強，從培養(yǎng)開始至36 h時，均未萌發(fā)，但未觀察到有孢子破裂（圖6-B）；A6-19-A6-28這些組分對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用仍相對較強，培養(yǎng)至12 h時有少量孢子萌發(fā)，36 h時萌發(fā)菌絲長度僅相當(dāng)于孢子徑的2-4倍，已萌發(fā)的菌絲膨大變粗（圖6-C）。

圖6 菌株BA-26抗菌粗提物RP-HPLC分離活性組分對灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制情況

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是革蘭氏陽性需氧型桿菌，產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)豐富。Ashokkumar等［18］從紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中分離出解淀粉芽孢桿菌VCRC B483通過80%硫酸銨沉淀獲得的粗提物顯示對鐮刀菌屬和新月彎孢霉屬的抗菌活性；盧彩鴿等［19］從漠河多年永凍土層中分離的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌MH71，對多種植物病原真菌和細(xì)菌具有較強的拮抗作用，發(fā)酵液對番茄灰霉病的防效為92.8%。本研究中BA-26菌株的抗菌粗提物顯示出強的抗不同真菌活性，對立枯絲核菌的抑菌活性最強，抑菌圈為40.0 mm。菌株BA-26的次級代謝產(chǎn)物對大部分病原真菌有顯著抑菌效果，具有開發(fā)為新型生防制劑的潛力。

關(guān)于芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的抑菌作用研究，通常是通過制備無菌發(fā)酵液或抗菌粗提物進(jìn)行。潘虹余等［12］探究了解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液對葡萄病原菌灰葡萄孢的抑菌機理，然而由于抗菌物質(zhì)種類較多，對于某一種物質(zhì)的抑菌作用并不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌BA-26發(fā)酵液中產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對灰葡萄孢菌絲生長發(fā)育的影響，主要表現(xiàn)在菌絲畸形膨大變粗、分支菌絲生長受阻、細(xì)胞膜被破壞通透性增加。此外，最強抗真菌活性物質(zhì)的最小抑菌濃度為7.81 μg/mL，對灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制效果明顯。

顯微鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)A6-15組分處理的菌絲，菌絲形態(tài)變化不明顯，未出現(xiàn)膨大變粗，也未觀察到菌絲內(nèi)容物外流。但A6-19-A6-28這些組分在其抗菌物質(zhì)的作用下菌絲形態(tài)變化明顯，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，菌絲細(xì)胞畸形，菌絲體彎曲變粗，中部腫脹，頂端膨大，分枝菌絲生長受阻。本實驗中11種活性組分的濃度均為1 mg/mL，已達(dá)到其最小抑菌濃度。此實驗結(jié)果可能是由于A6-15組分中抗菌物質(zhì)的最小抑菌濃度比A6-19-A6-28這些組分明顯高造成的，A6-15組分中的抗菌物質(zhì)能否使真菌菌絲形態(tài)發(fā)生相似的改變，還需在不同濃度下進(jìn)行實驗驗證。而在活性組分對孢子萌發(fā)影響的實驗中，觀察到相反結(jié)果，雖然A6-15組分中抗菌物質(zhì)的最小抑菌濃度比A6-19-A6-28這些組分明顯高，但A6-15組分中抗菌物質(zhì)對孢子萌發(fā)抑制作用更強。不同抗菌物質(zhì)之間是否存在協(xié)同抑菌作用，不同濃度下對真菌菌絲和孢子萌發(fā)的抑制作用有無差異，還有它們都有哪些作用機制。這些問題都將是未來的研究方向。

從解淀粉芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物中分離抗菌物質(zhì)的報道，朱弘元［20］在對解淀粉芽孢桿菌B15有效抑菌成分研究時發(fā)現(xiàn)了親水性和親脂性的脂肽類物質(zhì)，包括iturin A及其同系物、fengycin和surfactin類物質(zhì)，穩(wěn)定性研究表明酸堿、溫度和酶處理對抑菌活性沒有太大影響。本研究通過硫酸銨沉淀、大孔樹脂吸附及反相高效液相色譜技術(shù)，從解淀粉芽孢桿菌BA-26的發(fā)酵液中分離純化到11類抗真菌物質(zhì)，液相分析峰圖顯示它們不是單一物質(zhì)，這與芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)中可能存在很多結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體和同系物的特征相符。這些抗菌物質(zhì)易溶于水和極性有機溶劑的混合物，具有一定的親水性和親脂性。下一步，擬通過質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等現(xiàn)代波譜技術(shù)對液相色譜分離各組分活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

4 結(jié)論

從解淀粉芽孢桿菌BA-26發(fā)酵液中分離純化到11個具有抑制真菌作用的活性組分。該菌株抗真菌譜廣，對立枯絲核菌等多種植物病原真菌有強抑制作用，高效液相色譜純化活性組分中對灰葡萄孢抑菌活性最強的最小抑菌濃度為7.81 μg/mL。菌株BA-26產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)能使灰葡萄孢菌絲生長受阻、膨大變粗、細(xì)胞膜破壞并能抑制其孢子萌發(fā)。