松材線蟲拮抗細菌的殺線活性及其發(fā)酵培養(yǎng)特性

張婉君 吳小芹 王亞會

（1. 南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學林學院，南京 210037；2. 江蘇省有害生物入侵預防與控制重點實驗室，南京 210007）

松材線蟲病又稱為松樹萎蔫病（Pine wilt disease），是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一種松樹上的毀滅性病害，對我國生態(tài)和經(jīng)濟造成了重大損失，已引起了社會的廣泛關(guān)注［1］。目前關(guān)于松材線蟲病的防治主要包括化學防治和生物防治。其中，化學防治不僅易在植物體內(nèi)形成藥物殘留，使環(huán)境受到污染，生態(tài)失去平衡，還易使松材線蟲對藥物產(chǎn)生抗性［2］，導致其防治效果降低。因此對松材線蟲病的生物防治逐漸成為新的研究熱點。

目前，已報道的對松材線蟲有殺線活性的微生物包括真菌［3-5］、放線菌［6］和細菌［7-9］等。由于細菌培養(yǎng)簡單，生長繁殖速度快等特點，使生防細菌在生防微生物中占有重要的研究地位。現(xiàn)今對松材線蟲的生物防治以細菌為主，其中對芽孢桿菌屬細菌研究較多，如解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）［10］、短小芽孢桿菌（B.pumilus）［11］、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）［12］和蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）［13］等，其在松材線蟲生物防治中有著巨大的開發(fā)潛力。

在自然條件下，林間環(huán)境與實驗條件差異較大，可能會影響生防細菌的防治效果，因而研究生防細菌的培養(yǎng)條件和殺線物質(zhì)穩(wěn)定性顯得十分重要。有研究表明，芽孢桿菌對松材線蟲具有殺線蟲活性［10-11，13］。本實驗室前期從櫻花根際土壤和枝干上分別獲得蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）JK-XZ3和瓦雷茲芽孢桿菌（B. velezensis）YH-20，從黑松根際土壤分離出一株短小芽孢桿菌（B. pumilus）HR10，初步研究表明這3株細菌對部分林木病原菌具有較好的拮抗作用，但它們對松材線蟲是否有拮抗作用尚未見報道。本研究擬采用浸測法對以上3株細菌進行殺線活性的測定，并對篩選出的高效殺線菌株培養(yǎng)條件及殺線物質(zhì)的穩(wěn)定性進行測定，旨在獲得高效殺線菌株，為今后繼續(xù)開展殺線活性物質(zhì)的分離純化，開發(fā)應(yīng)用防治松材線蟲的生物制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與松材線蟲蟲株 供試蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）JK-XZ3分離自徐州櫻花根際土壤；短小芽孢桿菌（B. pumilus）HR10分離自黑松和黃色須腹菌菌根際土壤；瓦雷茲芽孢桿菌（B.velezensis）YH-20分離自上海櫻花枝干上。供試松材線蟲蟲株為AMA3，分離于安徽省馬鞍山市自然感染松材線蟲病死亡的馬尾松（Pinus massoniana），線蟲用灰葡萄孢（Botrytis cinerca）培養(yǎng)繁殖備用。以上菌株和線蟲蟲株均保存于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲的培養(yǎng) 將供試松材線蟲接種于長滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基平板中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲完全被取食。采用Berman漏斗法收集線蟲［16］，將收集到的線蟲用無菌水洗3次，配制成濃度約為5 000條/mL的線蟲懸液，備用。

1.2.2 細菌發(fā)酵濾液的制備 將保存的3株細菌菌株接種到含50 mL NB培養(yǎng)液的150 mL錐形瓶中，于28℃，200 r/min搖床搖培4 d，8000 r/min離心10min，上清液用0.22 μm細菌過濾器過濾，即得細菌發(fā)酵濾液，備用。

1.2.3 細菌對松材線蟲殺線活性測定及線蟲蟲體形態(tài)觀察 取3株細菌的發(fā)酵濾液各100 μL分別加入1.5 mL 的離心管中，接著加入100 μL 線蟲懸液（約500條），混勻。分別處理線蟲24 h和48 h后吸取混合液20 μL（約50條線蟲）在顯微鏡下觀察松材線蟲的死亡數(shù)目（線蟲蟲體僵直，蟲體呈“J”形或“C”形，蟲體體表無光澤，視為死亡［17］）及松材線蟲總數(shù)，計算死亡率和校正死亡率［18］，以無菌NB培養(yǎng)液處理為對照，每個處理重復3次。

進一步將3株細菌發(fā)酵濾液稀釋2倍、4倍和10倍分別與線蟲懸液以1∶1體積混合處理松材線蟲48 h后，比較3株細菌的殺線活性，并用顯微鏡觀察高效拮抗細菌在不同稀釋倍數(shù)下松材線蟲蟲體形態(tài)變化，每個處理重復3次。

1.2.4 不同培養(yǎng)溫度下高效拮抗細菌發(fā)酵濾液殺線活性測定 將篩出的高效拮抗細菌接種到NB培養(yǎng)液中，分別置于20、25、30、35和40℃搖床搖培4d，收集菌株發(fā)酵濾液，分別測定其4倍、8倍和20倍稀釋液處理松材線蟲48 h后的殺線活性。以無菌NB培養(yǎng)液處理為對照，每個處理重復3次。

1.2.5 不同培養(yǎng)時間下高效拮抗細菌發(fā)酵濾液殺線活性測定 將篩出的高效拮抗細菌接種到NB培養(yǎng)液中，置于30℃、200 r/min搖床，分別搖培1 d、3 d、4 d、5 d和7 d，收集菌株發(fā)酵濾液，分別測定其4倍、8倍和20倍稀釋液處理松材線蟲48 h后的殺線活性。以無菌NB培養(yǎng)液處理為對照，每個處理重復3次。

1.2.6 高效拮抗細菌發(fā)酵濾液殺線活性的熱穩(wěn)定性測定 取高效拮抗細菌發(fā)酵濾液分別在40、60、80、100℃處理1 h和121℃處理20 min，測定處理后的發(fā)酵濾液8倍稀釋液處理松材線蟲48 h后的殺線活性。以未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液和NB培養(yǎng)液分別作為陽性對照和空白對照，每個處理重復3次。

1.2.7 高效拮抗細菌發(fā)酵濾液殺線活性的酸堿穩(wěn)定性測定 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將高效拮抗細菌發(fā)酵濾液pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9和10，靜置12 h后離心取上清，測定經(jīng)不同pH處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液處理松材線蟲48 h后的殺線活性，分別以上述相同pH下的NB培養(yǎng)液和未經(jīng)酸堿處理的發(fā)酵濾液（原pH為8.8）8倍稀釋液作為空白對照和陽性對照，每個處理重復3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.6和 WPS 軟件進行數(shù)據(jù)圖表處理，用SPSS 19軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 松材線蟲拮抗細菌的篩選及殺線活性的比較

測定結(jié)果（表1）表明，蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3、短小芽孢桿菌HR10和瓦雷茲芽孢桿菌YH-20對松材線蟲均有殺線活性。處理24 h后，松材線蟲的校正死亡率均在40%以上；處理48 h后，松材線蟲的校正死亡率均達100%。進一步將3株細菌發(fā)酵濾液分別稀釋后處理松材線蟲48 h測定發(fā)現(xiàn)，4倍稀釋液下，3株菌株的殺線活性沒有顯著差異（P＜ 0.05），松材線蟲的校正死亡率分別達99.55%、99.29%和83.82%。8倍和20倍稀釋液下，蠟樣芽孢桿菌JKXZ3的殺線活性顯著高于其他2株菌株（P＜ 0.05），松材線蟲的校正死亡率分別為88.32%和22.52%。綜合這3株細菌發(fā)酵濾液及其不同稀釋倍數(shù)下的殺線活性，選取蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3進行后續(xù)試驗。

表1 3株細菌發(fā)酵濾液對松材線蟲殺線活性的比較

2.2 蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液稀釋不同倍數(shù)處理松材線蟲后蟲體形態(tài)觀察

蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液稀釋不同倍數(shù)后處理松材線蟲，發(fā)現(xiàn)蟲體形態(tài)發(fā)生明顯變化，如蟲體內(nèi)含物消解；蟲體出現(xiàn)膨大后體液外滲；蟲體斷裂（圖1）。觀察發(fā)現(xiàn)隨著稀釋倍數(shù)的增加，松材線蟲的消解率逐漸降低。同一稀釋倍數(shù)下隨著處理時間的延長，松材線蟲的消解率逐漸升高。在不同稀釋倍數(shù)下處理松材線蟲24 h后，發(fā)酵濾液4倍和8倍稀釋液中線蟲的消解率分別為46.94%和23.32%，20倍稀釋液無消解現(xiàn)象。處理48 h后，發(fā)酵濾液4倍、8倍和20倍稀釋液中線蟲的消解率分別為75.86%、56.62%和1.22%。

圖1 蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液處理松材線蟲后的蟲體形態(tài)觀察

2.3 不同培養(yǎng)溫度下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液的殺線活性

不同培養(yǎng)溫度下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液處理松材線蟲48 h后的殺線活性表明（圖2），相同溫度下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，其殺線活性顯著降低（P＜ 0.05），隨著溫度的升高，相同稀釋倍數(shù)下發(fā)酵濾液殺線活性先升高后降低。4倍稀釋液在30℃和35℃時表現(xiàn)出較高的殺線活性，松材線蟲的校正死亡率均為100%；8倍和20倍稀釋液在30℃時殺線活性均高于其他培養(yǎng)溫度下的殺線活性，松材線蟲的校正死亡率分別為100%和33.68%；說明蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3在30℃培養(yǎng)更有助于殺線物質(zhì)的分泌。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液對松材線蟲的校正死亡率

2.4 不同培養(yǎng)時間下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液的殺線活性

不同培養(yǎng)時間下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液處理松材線蟲48 h的殺線活性測定表明（圖3），相同培養(yǎng)時間下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，其殺線活性逐漸降低。在不同培養(yǎng)時間下，相同稀釋倍數(shù)的殺線活性差異顯著（P＜ 0.05），在4倍和8倍稀釋液下，培養(yǎng)4 d的殺線活性最高，松材線蟲的校正死亡率均為100%；在20倍稀釋液下，培養(yǎng)4 d的殺線活性明顯高于其他培養(yǎng)時間下的殺線活性，松材線蟲的校正死亡率為39.99%。說明蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3分泌殺線物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時間為4 d。

圖3 不同培養(yǎng)時間下蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液對松材線蟲的校正死亡率

2.5 蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液殺線活性的熱穩(wěn)定性

蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度（40、60、80、100 和 121℃）處理后的殺線活性表明（圖4），松材線蟲在40、60、80和100℃下處理后的發(fā)酵濾液8倍稀釋液中處理48 h后，其校正死亡率達84%以上，在121℃下處理后的發(fā)酵濾液8倍稀釋液中殺線活性迅速下降，其校正死亡率為33.19%，顯著低于未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液（100%）（P＜ 0.05），說明蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液中的殺線物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.6 蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液殺線活性的酸堿穩(wěn)定性

蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH處理后的殺線活性表明（圖5），松材線蟲在pH為8-10的發(fā)酵濾液8倍稀釋液中處理48 h后，其校正死亡率達88%以上，與未經(jīng)酸堿度處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液（原pH為8.8）（100%）無顯著差異（P＜0.05），說明發(fā)酵濾液中具有殺線活性的物質(zhì)受堿性條件影響較小；在pH為4-6的發(fā)酵濾液8倍稀釋液中處理48 h后，其校正死亡率達8%-25%，顯著低于未經(jīng)酸堿度處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液（100%），說明在酸性條件下發(fā)酵濾液中具有殺線活性的物質(zhì)易失活。因此表明，蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液中具有殺線活性的物質(zhì)在堿性條件下是比較穩(wěn)定的。

圖4 不同溫度處理蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液對松材線蟲的校正死亡率

圖5 不同pH處理蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液對松材線蟲的校正死亡率

3 討論

由松材線蟲引起的松樹萎蔫病對森林的危害日益加重，研究者們嘗試采用化學藥劑進行松材線蟲病防治，但化學藥劑的使用對生態(tài)環(huán)境及人類安全造成隱患，因此生物防治逐漸成為新的研究熱點。據(jù)報道，至今已發(fā)現(xiàn)多種對松材線蟲具有殺線蟲活性的芽孢桿菌［10-11，13］。本研究從3株供試芽孢桿菌中篩選出1株蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3，其發(fā)酵濾液具有高效殺線活性，發(fā)酵濾液4倍、8倍和20倍稀釋液處理48 h后松材線蟲的校正死亡率分別為99.55%、88.32%和22.52%，均高于短小芽孢桿菌HR10和瓦雷茲芽孢桿菌YH-20處理的松材線蟲。李亮亮等［14］選出一株蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）NJSZ-13，其菌懸液（105CFU/mL）對松材線蟲有較高的殺線活性，處理48 h后殺線活性達81.5%，但該菌株的發(fā)酵濾液殺線活性較弱，而本文研究的蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液稀釋8倍后仍有較高的殺線活性，有利于今后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。一些研究發(fā)現(xiàn)微生物會使線蟲組織消解或形成空泡現(xiàn)象，如Geng等［19］以秀麗隱桿線蟲作為模型，研究堅強芽孢桿菌（B. firmus）DS-1的肽酶S8超家族蛋白Sep1的殺線機制，結(jié)果表明Sep1可以降解線蟲腸和角質(zhì)層相關(guān)蛋白并破壞宿主物理屏障。Liu等［20］研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬（Streptomycessp.）AN091965發(fā)酵濾液中的spectinabilin物質(zhì)處理松材線蟲在光學顯微鏡下觀察到死亡線蟲的組織解體和空泡形成。朱麗梅等［21］篩選的解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）JK-JS3處理松材線蟲24 h后部分僵直蟲體，身體局部膨大并從膨大部位出現(xiàn)體液外滲，進而導致蟲體斷裂并消解的現(xiàn)象。而本研究在顯微鏡下也觀察到蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液處理后死亡線蟲體腔內(nèi)內(nèi)容物消解、蟲體局部膨大并出現(xiàn)體液外滲、蟲體斷裂現(xiàn)象，推測該菌株發(fā)酵濾液中可能存在一些可破壞線蟲體壁組織的物質(zhì)。

由于細菌在發(fā)酵的過程中會受到培養(yǎng)條件，環(huán)境等多方面的影響，而難以發(fā)揮其潛在的生物學功能。為使細菌在發(fā)酵過程中能分泌更多的殺線活性成分，因此對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。本研究通過比較蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3在不同培養(yǎng)溫度和不同培養(yǎng)時間下發(fā)酵濾液對松材線蟲殺線活性，表明蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3在30℃下培養(yǎng)4 d的發(fā)酵濾液殺線活性最強，其4倍和8倍稀釋液處理48 h后松材線蟲的校正死亡率均達100%；20倍稀釋液處理48h后松材線蟲的校正死亡率達39.99%，比未優(yōu)化之前（22.52%）提高了17.47%，為今后規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

由于發(fā)酵液中的物質(zhì)成分復雜，了解發(fā)酵液中殺線活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，有益于后續(xù)研究中利用特定的方法將其分離純化。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌（B. pumilus）LYMC-3培養(yǎng)濾液經(jīng)過高溫處理后對松材線蟲的殺線活性無降低，表明殺線成分可能是非蛋白類物質(zhì)，經(jīng)分離提純后發(fā)現(xiàn)是一種胍類化合物。本研究蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液在40、60、80和100℃處理后，8倍稀釋液處理48 h后松材線蟲的校正死亡率均達84%以上，表明發(fā)酵濾液中具殺線活性的物質(zhì)具有耐高溫特性，推測可能也屬于非蛋白類物質(zhì)；進一步研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液經(jīng)堿（pH為8-10）處理后，其8倍稀釋液對松材線蟲的殺線活性與未處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液無顯著差異，這與李恩杰等［15］研究發(fā)現(xiàn)菌株D發(fā)酵濾液具有耐堿特性一致。而經(jīng)酸（pH 4-6）處理后，8倍稀釋液的殺線活性明顯低于未處理的發(fā)酵濾液8倍稀釋液，可能因酸處理后具有殺線活性的物質(zhì)留在了酸沉淀中。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌LYMC-3培養(yǎng)濾液在堿性條件下較穩(wěn)定，經(jīng)強酸處理后，培養(yǎng)濾液上清液對松材線蟲的殺線活性顯著降低，培養(yǎng)濾液酸沉淀物經(jīng)堿溶解后處理線蟲的死亡率分別達100%和86.4%，說明菌株培養(yǎng)濾液在酸性條件下不穩(wěn)定，具有殺線活性的物質(zhì)存在于酸沉淀中。由此推測本試驗中具有殺線活性的物質(zhì)在酸性條件下是否也存在酸沉淀中而導致發(fā)酵濾液的殺線活性降低，還需進一步驗證。該研究結(jié)果為今后殺線菌株物質(zhì)的分離純化具有指導意義。

4 結(jié)論

本研究對蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3，瓦雷茲芽孢桿菌YH-20和短小芽孢桿菌HR10的發(fā)酵濾液進行殺線活性的測定，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3發(fā)酵濾液在不同稀釋倍數(shù)下對松材線蟲的殺線活性均高于其他兩株芽孢桿菌，對線蟲蟲體有明顯的消解作用；該菌株在30℃下培養(yǎng)4 d的發(fā)酵濾液4倍和8倍稀釋液處理48 h后松材線蟲的校正死亡率均達100%；其發(fā)酵濾液具有耐熱和耐堿性的特性。該研究結(jié)果為今后蠟樣芽孢桿菌JK-XZ3的開發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。