來自光裸方格星蟲產(chǎn)纖溶酶蠟狀芽孢桿菌的鑒定

李小媚 周宗慧 尹秀華 江虹銳 劉小玲

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004）

血栓性疾病是由血栓形成和栓塞引起的一系列疾病的統(tǒng)稱。急性血栓性疾病的治療方式主要有外科手術(shù)抗凝管介入溶栓、手術(shù)取栓及濾器置入、服用抗凝劑以及溶栓療法等。針對(duì)急性血栓疾病，目前PCI術(shù)的治療效果最佳，但溶栓劑成本較低，在不能及時(shí)進(jìn)行PCI術(shù)的情況下可以快速實(shí)現(xiàn)血管再通，纖溶酶是最常見的溶栓劑之一［1］。纖溶酶又稱為纖維蛋白溶解酶，能特異性降解血栓的主要成分纖維蛋白，因此能溶解血栓，起到疏通血管的作用，在臨床上可用于治療血栓性疾?。?］。天然纖溶酶的來源多樣化，有動(dòng)物、植物和微生物，其中，微生物是一個(gè)重要來源，現(xiàn)已報(bào)道出來的產(chǎn)纖溶酶的微生物種類豐富，如海洋假單胞菌、南方小藥酒中的根霉、納豆中的枯草芽孢桿菌等［3］。

光裸方格星蟲（Sipunculus nudus）又名沙蟲，主要分布于太平洋、大西洋、印度洋沿岸，我國(guó)沿海均有分布，其中廣西沿海區(qū)域資源量最為豐富，其體內(nèi)具有溶解纖維蛋白的酶。有研究表明，光裸方格星蟲的微生物多樣性豐富，可培養(yǎng)的微生物包括有Bacillus、Leucobacter、Pseudomonas等多個(gè)屬，是一種良好的微生物來源［4］。目前，光裸方格星蟲纖溶酶大多由蟲體直接提取，未見來源于其共生微生物的相關(guān)報(bào)道。本研究擬以光裸方格星蟲為原料，采用脫脂乳平板、纖維蛋白板聯(lián)合篩選的方式分離出一株纖溶酶產(chǎn)量高的菌株，并探究其血栓溶解機(jī)理和纖溶活性，為今后利用分子生物學(xué)手段提高產(chǎn)量和生產(chǎn)適用工程菌的選育奠定基礎(chǔ)，為海洋微生物來源纖溶酶的工業(yè)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

光裸方格星蟲產(chǎn)地為廣西北海市，平均重量（25.0±2.2）g，平均長(zhǎng)度（17.0±1.1）cm，采集日期2018年9月30日。采集后即刻海水保濕（海水來自廣西北海海域），運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 脫脂乳平板培養(yǎng)基：將10%（W/V）的脫脂乳和4%（W/V）的瓊脂分別進(jìn)行121℃，1×105Pa滅菌20 min，冷卻至50℃混勻，作為產(chǎn)蛋白酶初篩平板培養(yǎng)基。

菌株分離與發(fā)酵培養(yǎng)基：2216E海生菌液體培養(yǎng)基購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，于121℃，1×105Pa滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌株的分離純化 新鮮方格星蟲的體表用1%無菌NaCl溶液清洗8次至表面清潔后，放進(jìn)無菌玻璃研缽中，按1∶2（W/V）加入1% NaCl溶液充分研磨。用1% NaCl溶液將研磨液進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋，在2216E海生菌固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，26℃恒溫培養(yǎng)3 d。挑取完整的單菌落于2216E海生菌固體培養(yǎng)基分離純化，直至獲得純菌，即固體培養(yǎng)基上無其他形態(tài)的菌落。將收集的海水進(jìn)行相同梯度稀釋，并涂布至2216E海生菌固體培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落分離純化，所得純菌作為對(duì)照組。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶活性菌的篩選 挑取純化后的單菌落放入含有100 μL/孔2216E海生菌液體培養(yǎng)基的96孔板中，26℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)24-48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每株菌的發(fā)酵液按2 μL/孔取出涂布在脫脂乳平板上，于30℃恒溫倒置培養(yǎng)48-72 h。將形成明顯溶解圈的菌株做好標(biāo)記，為具有產(chǎn)蛋白酶活性菌。每個(gè)純化后的單菌落作3組平行試驗(yàn)。

1.2.4 產(chǎn)纖溶酶活性菌株的篩選 用無菌牙簽將分離純化后，具有產(chǎn)蛋白活性的單菌落接種至脫脂乳平板，30℃恒溫倒置培養(yǎng)48-72 h，用微生物計(jì)數(shù)儀測(cè)量溶解圈和菌落的直徑大小，得出溶解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值，選取D/d比值大于1的菌株作為目的發(fā)酵菌株。目的菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h，收集發(fā)酵液于4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液得到發(fā)酵粗酶液，采用纖維蛋白板測(cè)定粗酶液酶活。選取酶活最高的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.5 纖維蛋白板的制作 纖溶酶酶活用纖維蛋白板法測(cè)定，纖維蛋白板的制作參考Astrup等［5］的方法。將0.02 g牛纖維蛋白原加入10 mL 0.9% NaCl溶液中于37℃充分溶解。取5 mL 10 U/mL凝血酶于37℃中水浴備用。0.2 g瓊脂糖加入到10 mL超純水中，滅菌使用。無菌的瓊脂糖溶液冷卻到45℃時(shí)加入凝血酶，混勻后再加入10 mL 濃度為0.002 g/mL牛纖維蛋白原溶液，快速混勻后倒平板。纖維蛋白板凝固后室溫水平倒置3 h，用直徑為3 mm的玻璃管打孔備用。

1.2.6 菌株產(chǎn)纖溶酶活力的測(cè)定 分別配制濃度為100、200、300、400、500 U/mL的尿激酶溶液，各取10 μL加入直徑為3 mm的纖維蛋白孔中，在室溫下靜置10 min后，37℃恒溫培養(yǎng)18 h測(cè)量溶解圈垂直直徑大小。以尿激酶纖溶活性的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，溶解圈垂直直徑平方的對(duì)數(shù)（lgA）為縱坐標(biāo)，得出尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.282 7x+2.2558（R2=0.994 1）。將10 μL發(fā)酵粗酶液加到纖維蛋白板的孔中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h后測(cè)量纖溶圈垂直直徑大小，由尿激酶曲線得出菌株粗酶液酶活力。以0.9%NaCl溶液作為陰性對(duì)照組（Negative Control，NC）。

1.2.7 菌株形態(tài)以及生理生化鑒定 將篩選出的產(chǎn)纖溶酶菌株菌液經(jīng)2216E瓊脂培養(yǎng)基劃線進(jìn)行37℃培養(yǎng)12 h，挑取新鮮菌苔經(jīng)0.9%生理鹽水梯度稀釋制備濃度為3×108CFU/mL菌懸液，采用細(xì)菌新型生化鑒定管（購(gòu)于廣東環(huán)凱生物科技有限公司）對(duì)篩出的菌株進(jìn)行厭氧試驗(yàn)、過氧化氫、運(yùn)動(dòng)性、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原、生長(zhǎng)溫度、溶菌酶耐性、蛋白質(zhì)毒素、耐鹽性等生理生化鑒定［6］。

1.2.8 16S rDNA PCR擴(kuò)增與序列鑒定與生物信息學(xué)分析 采用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA作為PCR的模板，PCR所用引物為細(xì)菌通用引物27F和1492R，其序列為：正向引物（27F）：5′-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3′；反向引物（1492R）：5′-TACGGCTACCTTCTTACCACTT-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后的測(cè)序由南寧國(guó)拓生物科技有限公司完成。測(cè)序結(jié)果的同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建在NCBI的搜索工具BLAST進(jìn)行。根據(jù)同源比對(duì)結(jié)果分析，下載高同源性的菌株16S rDNA序列。將實(shí)驗(yàn)菌株與同源性菌株用MEGA5.0的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.9 酶的作用機(jī)制研究 按照1.2.5所述的方法配制纖維蛋白平板，經(jīng)過85℃，30 min熱處理的纖維蛋白板稱為加熱平板，未進(jìn)行熱處理的纖維蛋白板稱為未加熱平板。分別取10 μL來源于光裸方格星蟲試驗(yàn)菌株發(fā)酵粗酶液與同等酶活的尿激酶加入加熱平板和未加熱平板中，于37℃培養(yǎng)18 h觀察纖溶圈，以此判斷該試驗(yàn)菌株所產(chǎn)纖溶酶溶解血栓的作用機(jī)制［7］。重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.2.10 體外溶血實(shí)驗(yàn) 取新鮮雞血靜置30 min后，經(jīng)5 000 r/min離心10 min，去除上清液，吸干表面的血清。將凝血塊切成15 mm×5 mm×3 mm小塊，加入無菌試管中，再分別加入1 mL的0.9%NaCl和粗酶液，置于37℃恒溫水浴，6 h后小心取出血塊，用濾紙條吸干血塊表面水分，進(jìn)行稱量，以血塊溶解率公式計(jì)算粗酶溶解血栓的能力，重復(fù)實(shí)驗(yàn)平行3次。血塊溶解率公式［8］：

其中，M1為凝血塊溶解前質(zhì)量；M2為凝血塊溶解后質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)纖溶酶菌株篩選結(jié)果

通過脫脂乳平板從光裸方格星蟲和海水樣品中共篩出8株產(chǎn)蛋白酶菌株（圖1）。利用纖維蛋白板進(jìn)行復(fù)篩，有6株菌具有產(chǎn)纖溶酶的能力（表1，圖2），其中6號(hào)菌來自海水對(duì)照組，命名為GXUSPL-2菌株；3號(hào)菌為光裸方格星蟲中產(chǎn)酶能力最強(qiáng)菌株，將其命名為GXUSPL-1菌株，其余產(chǎn)酶菌株均來自光裸方格星蟲。由尿激酶線性回歸方程得出GXUSPL-1菌株粗酶液的酶活力為303.2 U/mL，GXUSPL-2菌株則為251.4 U/mL。

圖1 初篩菌株在脫脂乳平板中產(chǎn)生的溶解圈

表1 產(chǎn)纖溶酶菌株篩選結(jié)果

圖2 復(fù)篩菌在纖維蛋白板產(chǎn)生的溶解圈

2.2 產(chǎn)纖溶酶活性菌株鑒定以及生理生化特性

圖3 菌落形態(tài)

2.2.1 產(chǎn)纖溶酶菌株的菌落形態(tài) GXUSP-1和GXUSP-2經(jīng)過恒溫培養(yǎng)48 h后菌落形態(tài)相似（圖3），單菌落呈橙紅色，中心凸起，邊緣成鋸齒狀或波浪狀，表面粗糙，質(zhì)地不透明。

2.2.2 菌株生理生化特性 由表2可知，GXUSP-1菌株在還原硝酸鹽和產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素呈陰性，在5、10以及50℃的生長(zhǎng)環(huán)境中不能生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)溫度45℃，V-P測(cè)定、過氧化氫、溶菌酶耐性均為陽(yáng)性，具有運(yùn)動(dòng)性，專性厭氧，耐鹽性強(qiáng)，鹽的耐受值達(dá)到10%；GXUSP-2菌株在還原硝酸鹽顯陽(yáng)性，其他特征均與GXUSP-1菌株相同，根據(jù)菌株形態(tài)特征與生理生化特性，可初步鑒定兩株菌均屬于蠟狀芽孢桿菌。

2.2.3 16S rDNA PCR結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 提取細(xì)菌總DNA作為模板，采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳得到結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 600 bp左右（圖4）。 將 GXUSP-1的 16S rDNA 序 列 在 NCBI中 的nucleotide blast核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，GXUSP-1與多株菌相似度達(dá)到99%。根據(jù)該菌在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，使用其在數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性達(dá)到99%以上的部分同源、同屬和同種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖5可以看出，GXUSP-1與GXUSP-2自展支持率為65%，且兩株菌與MH041184.1Bacillus cereus strain自展支持率高達(dá)100%。因此，GXUSP-1屬于蠟狀芽孢桿菌屬（Bacillus cereus），同時(shí)也是海洋共生菌。

表2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

圖4 16S rDNA PCR電泳圖

2.2.4 酶的作用機(jī)制 GXUSP-1經(jīng)過72 h發(fā)酵離心得到粗酶液。通過粗酶在纖維蛋白板與纖維蛋白板形成的溶解圈判斷GXUSP-1菌株纖溶酶溶解纖維蛋白的作用方式。加熱平板中的纖溶酶原由于受熱而失活，僅能反映出酶的直接作用方式。未加熱平板體現(xiàn)的是纖溶酶直接和間接作用于纖維蛋白的雙重作用。結(jié)果表明，該酶在這兩種纖維蛋白板均有溶解圈出現(xiàn)，未加熱平板中的溶解圈直徑15.3±0.02 mm顯著高于加熱平板13.8±0.06 mm；而尿激酶僅在未加熱平板中出現(xiàn)溶解圈，說明其對(duì)纖維蛋白的降解是通過間接方式。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，GXUSP-1菌株纖溶酶與尿激酶的作用方式明顯不同。

2.2.5 體外溶血實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)性凝血塊的溶血作用，探究GXUSP-1菌株的粗酶液對(duì)血栓的降解能力。同一溫度下，凝血塊的溶解率越高，說明其對(duì)血栓溶解效果更佳。結(jié)果（圖6）可得知GXUSP-1菌株的粗酶液對(duì)血栓具有明顯降解作用，經(jīng)過37℃，6 h的作用后，凝血塊的溶解率可達(dá)到39.64%。而0.9%的生理鹽水對(duì)血栓溶解率低于13%。

圖5 GXUSP-1 16S rDNA采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 GXUSP-1菌株的粗酶液對(duì)血栓的溶解作用

3 討論

我國(guó)的海洋生物資源豐富，海洋環(huán)境和陸地環(huán)境在含氧量、鹽濃度、以及溫度等方面都存在較大的差異。為了更好利用海洋微生物資源和尋找天然溶栓劑，許多研究以海洋中的不同物質(zhì)作為載體篩選出能產(chǎn)生天然纖溶酶的微生物，如海泥［9］、海水［10］，這些微生物大部分是細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌［11］，海洋假單胞菌［12］。光裸方格星蟲具有可食用性，其自身結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且具有溶解蛋白的物質(zhì)［13］。本研究從北海采集的光裸方格星蟲體內(nèi)篩選出5株產(chǎn)纖溶酶細(xì)菌，其中篩出的GXUSP-1菌株產(chǎn)纖溶酶酶能力（303.2 U/mL）最高。雖然GXUSP-1菌株纖溶酶活力低于張雪琴等［14］從蚯蚓中分離出的產(chǎn)纖溶酶的蠟狀芽孢桿菌初始發(fā)酵酶活（538.64 U/mL），但GXUSP-1在含鹽量10%的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中生長(zhǎng)繁殖良好，其菌株耐鹽性強(qiáng)于蚯蚓蠟狀芽孢桿菌。GXUSP-1菌株與海水來源的GXUSP-2菌株經(jīng)生理生化鑒定以及16S rDNA PCR技術(shù)可初步認(rèn)定均為蠟狀芽孢桿菌，僅在硝酸鹽還原性質(zhì)上有差異，由此說明GXUSP-1菌株為光裸方格星蟲與海水共生菌，但由于本次采樣地點(diǎn)單一，不能說明GXUSP-1的菌株來自特定海域，后期將增加其他海域的采樣點(diǎn)，分析光裸方格星蟲附生微生物產(chǎn)纖溶酶能力與海域是否有關(guān)。大多數(shù)研究表明，具有溶解蛋白特性的野生型菌株初始纖溶酶活力一般在100-300 U/mL［15］。本研究篩出的野生型GXUSP-1菌株的產(chǎn)酶能力高于一般水平，后續(xù)可以通過基因測(cè)序及比對(duì)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)探討來源不同的蠟狀芽孢桿菌對(duì)酶表達(dá)的基因差異和相關(guān)性。

尿激酶作為一種激活劑，將纖維蛋白板中的牛血纖維蛋白酶原激活為纖溶酶，能間接降解纖維蛋白的作用［16］。本研究將GXUSP-1作用于加熱前后的纖維蛋白板，并以尿激酶作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)GXUSP-1菌株纖溶酶能直接溶解血栓，并具有激活纖維蛋白原的作用，從而起到間接溶解血栓的目的。袁慎亮等［7］研究了從海泥中篩出沙福芽孢桿菌纖溶酶對(duì)血栓的特異性，發(fā)現(xiàn)沙福芽孢桿菌纖溶酶也可通過直接和間接作用溶解血栓，本研究結(jié)果與之相符合。GXUSP-1菌株纖溶酶在37℃條件下體外溶血實(shí)驗(yàn)中溶解率達(dá)到39.64%，遠(yuǎn)高于林芬等［8］從灑曲、酒糟、窖泥等原料中產(chǎn)纖溶酶菌株的血栓溶解率，該溶解率在25%左右。本實(shí)驗(yàn)為探究GXUSP-1菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性、酶的性質(zhì)分析，擴(kuò)大生產(chǎn)培養(yǎng)基優(yōu)化提供基礎(chǔ)，同時(shí)為研究和工業(yè)應(yīng)用提供菌株來源。

4 結(jié)論

篩選來源于光裸方格星蟲的產(chǎn)纖溶酶菌株，共獲得5株具有產(chǎn)纖溶酶活性的菌株，其中GXUSP-1產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，是一株可直接降解纖維蛋白的光裸方格星蟲海水共生菌，具有顯著的溶解血栓能力，其粗酶經(jīng)過分離純化后有望成為預(yù)防和治療血栓的保健品。經(jīng)鑒定GXUSP-1菌株與蠟狀芽孢桿菌具有最近的親緣關(guān)系，其代謝產(chǎn)酶的安全性分析以及菌株擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)條件有待于進(jìn)一步探索。