貓4種不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較

羅冬章 羅惠娜 詹小舒 李心怡 黃曼晴 林潔微 黃綺亮 洪純林好美 陳勝鋒 王丙云

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231）

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可從多種組織器官（骨髓、脂肪、胎盤和臍帶）中分離獲得。因其缺乏獨特的細(xì)胞膜表面標(biāo)記，所以國際干細(xì)胞協(xié)會認(rèn)為可以通過以下3個標(biāo)準(zhǔn)來辨別MSC，其中包括其生長貼壁性能、表達(dá)的一組細(xì)胞表面標(biāo)志物與多向分化的潛能［1］。

目前，對人、鼠和狗等的MSC生物學(xué)特性研究較多，而關(guān)于貓MSC的生物學(xué)特性的信息較少。2002年，Martin等［2］首次從貓骨髓中分離獲得MSC，通過對細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化能力和細(xì)胞表面標(biāo)記物的研究，發(fā)現(xiàn)貓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSC） 與嚙齒類或人類來源的BM-MSC非常相似。隨后不斷有人從不同來源的組織中分離獲得MSC。Jin等［3］研究表明貓臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）和骨髓來源的BM-MSC對神經(jīng)損傷治療是有效的。Quimby等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，貓自體BM-MSC和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSC）移植可治療貓慢性腎臟疾病。骨髓來源的MSC的生長活性和產(chǎn)量受到貓年齡的影響，而AD-MSC的活性更好和細(xì)胞產(chǎn)量更多。由此可見，不同來源的貓MSC對疾病的治療有一定的效果，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。本研究從貓脂肪、骨髓、臍帶和胎盤等4種不同組織中提取MSC，系統(tǒng)地比較它們的生物學(xué)特性，為后續(xù)的臨床應(yīng)用篩選種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 本實驗所取得的脂肪、骨髓、羊膜、臍帶均來自于一只1歲的健康母貓（家貓），體重約7 kg。取樣地點于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)院二樓。

1.1.2 主要試劑 0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、磷酸緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）和青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購自Hyclon（美國）；胎牛血清購于BioInd（以色列），DMEM/LOW培養(yǎng)液、間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)液購于Cyagen（中國）；CD44購自ThermoFisher（美國）、CD34和CD90購自 BDPharmingenTM（ 美 國 ）、CD105購 自 GeneTex（美國）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter（美國），超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司（中國），HHS型電熱恒溫水浴鍋購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（中國），離心機(jī)Eppendorf（德國），倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司（日本），CO2培養(yǎng)箱購自Shel Lab公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

1.2.1.1 BM-MSC的分離、培養(yǎng) 通過無菌術(shù)，抽取貓骨髓液0.5 mL于抗凝管中，加入2.5 mL含雙抗的PBS緩沖液稀釋，制成3 mL骨髓稀釋液。1 500r/min冷凍離心10 min，然后小心吸取下層血細(xì)胞，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細(xì)胞懸液，接種至60 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細(xì)胞長滿80%-90%，進(jìn)行傳代。

1.2.1.2 AD-MSC的分離及培養(yǎng) 通過無菌術(shù)，取貓皮下脂肪約拇指指甲蓋大小，放于含有雙抗PBS的15 mL離心管內(nèi)。取到的脂肪在無菌操凈臺內(nèi)依次用75%酒精浸泡3次，每次3 s，PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌兩次。然后剪碎約為1 mm2大小的組織塊，剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入兩倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃水浴鍋中消化30 min，終止消化。消化液用200目細(xì)胞篩過濾，濾液以1 200 r/min離心5min，棄去上清液。加入含1% L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細(xì)胞懸液，接種至60 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細(xì)胞長滿80%-90%，進(jìn)行傳代。

1.2.1.3 UC-MSC的分離及培養(yǎng) 取剛生產(chǎn)的母貓產(chǎn)后胎盤，在無菌操凈臺內(nèi)小心剝離臍帶組織，用75%酒精浸泡3次每次3 s，再用PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌2次。剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃培養(yǎng)箱中消化6 h，消化液用200目細(xì)胞篩過濾，濾液1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中，混勻制成細(xì)胞懸液，接種至60 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細(xì)胞長滿80%-90%，進(jìn)行傳代。

1.2.1.4 AM-MSC的分離培養(yǎng) 取剛生產(chǎn)的母貓產(chǎn)后，在無菌操凈臺內(nèi)小心剝離羊膜組織，用75%酒精浸泡3次每次3 s，再用PBS洗2次，最后使用含雙抗的PBS洗滌2次。剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5倍體積的濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，于37℃培養(yǎng)箱中消化1 h，消化液用200目細(xì)胞篩過濾，濾液1 200 r/min離心5min，棄上清，加入含1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM，混勻制成細(xì)胞懸液，接種至60 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液，以后每3 d換一次液，直到細(xì)胞長滿80%-90%，進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞生長曲線及計算倍增時間 取生長良好的P3、P6和P9代數(shù)的細(xì)胞，用胰酶消化后，制成細(xì)胞懸液，以2×104個/mL的細(xì)胞密度接種0.5 mL于24孔培養(yǎng)板中，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每間隔 2-3 d換一次液。24 h后開始進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以后每間隔24 h計數(shù)一次，每次隨機(jī)抽取3個孔進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果取3個孔的平均值，連續(xù)計數(shù)8 d。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計的結(jié)果，以單位細(xì)胞密度作為縱坐標(biāo)（個/mL），時間為橫坐標(biāo)來繪制生長曲線。根據(jù)公式1，計算細(xì)胞生長的倍增時間。

其中：t為細(xì)胞培養(yǎng)的時間（h），Nt是培養(yǎng)t時間后細(xì)胞的數(shù)量，N0是初始接種的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記 取P3代的4種細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%時，用0.25%的胰酶消化、用含10%FBS的培養(yǎng)基終止，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加PBS緩沖液清洗2次、1 200 r/min離心5 min。分別加入抗體CD34、CD44、CD90和CD105，室溫孵育20 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.2.4 成脂成骨誘導(dǎo)分化

1.2.4.1 成脂誘導(dǎo)分化 分別取P3代的4種細(xì)胞，接種到24孔板，置于38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d進(jìn)行換液，等到細(xì)胞融合達(dá)到80%-90%時，用吸管吸取、棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL的成脂誘導(dǎo)分化A液開始進(jìn)行誘導(dǎo)，連續(xù)培養(yǎng)2 d，2 d后更換為成脂誘導(dǎo)分化B液，繼續(xù)培養(yǎng)1 d，1 d后再更換為成脂誘導(dǎo)分化A液進(jìn)行誘導(dǎo)，2 d后更換一次為成脂誘導(dǎo)分化B液，如此重復(fù)幾個循環(huán)。2周后可看到脂滴，當(dāng)脂滴出現(xiàn)較多、脂滴增大時進(jìn)行油紅O染色。

1.2.4.2 成骨誘導(dǎo)分化 分別取P3代的4種細(xì)胞，接種到24孔板，置于38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d進(jìn)行換液，等到細(xì)胞融合達(dá)到80%-90%時，用吸管吸取、棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL的成骨分化液進(jìn)行培養(yǎng)。以后每隔3 d換液一次，誘導(dǎo)細(xì)胞分化持續(xù)1-2周。經(jīng)過1-2周的誘導(dǎo)后，在顯微鏡下觀察到有鈣結(jié)節(jié)形成，再進(jìn)行茜素紅染色。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，兩獨立樣本比較采用獨立樣本t檢驗，不同組間采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞培養(yǎng)在48 h換液后，4種細(xì)胞均可以看到有細(xì)胞貼壁，大部分細(xì)胞形態(tài)呈圓形、多邊形梭形，少數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，折光性弱。

AD-MSC在第7天時，細(xì)胞融合達(dá)到90%，細(xì)胞生長時呈圓形、短梭形增殖，增殖速度較快。BM-MSC細(xì)胞在培養(yǎng)的前5 d可見少量的細(xì)胞死亡，在第7 天時細(xì)胞融合達(dá)到90%，細(xì)胞呈長梭形、多棱形、旋渦狀生長。

AM-MSC和UC-MSC的細(xì)胞，可見部分不規(guī)則胞質(zhì)散大、折光性弱的細(xì)胞，在培養(yǎng)的過程中死細(xì)胞較多，在第12天時細(xì)胞才融合90%，且細(xì)胞胞質(zhì)較大，折光性較BM-MSC和AD-MSC差（圖1）。

2.2 生長曲線

根據(jù)繪制的4種MSC的生長曲線（圖2）可知，4種細(xì)胞在接種的前2 d增殖比較緩慢。AD-MSCC和BM-MSC在第3天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，AD-MSC到P9代依然保持良好活性；P6和P9代BM-MSC在第7天進(jìn)入平臺期，第8天開始衰退；AM-MSC和UC-MSC的增殖速度慢，不出現(xiàn)對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖呈線性生長，P6和P9代細(xì)胞在第5天開始進(jìn)入平臺期，第7天開始衰退。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，計 算AD-MSCC、BM-MSC、AM-MSC和 UC-MSC的群體平均倍增時間（表1）。

圖1 四種不同來源的MSC細(xì)胞生長形態(tài)（標(biāo)尺=100 μm）

表1 四個不同來源MSC的P3，P6和P9的細(xì)胞倍增時間（±S，n=3）

表1 四個不同來源MSC的P3，P6和P9的細(xì)胞倍增時間（±S，n=3）

注：不同小寫字母表示差異顯著性，P ＜0.05

AD-MSC BM-MSC AM-MSC UC-MSC P3 30.46±1.50a 36.51±2.50ab 55.85±3.34c 58.06±2.68cd P6 34.35±2.09ae 43.23±2.40f 113.20±7.14g 98.98±3.39h P9 37.0±1.73bei 81.16±2.56j 128.08±5.34k 105.59±4.40l

2.3 MSC免疫熒光鑒定

流式細(xì)胞檢測結(jié)果（圖3，表2）顯示，4種細(xì)胞表面CD44、CD90和CD105均是強(qiáng)陽性表達(dá)，而CD34低表達(dá)。

2.4 成脂成骨分化鑒定

在成骨誘導(dǎo)分化液的作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下觀察，4種細(xì)胞均能看到鈣結(jié)節(jié)生成。經(jīng)茜素紅染色后，呈紅色。BM-MSC第5天出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，出現(xiàn)最早，其他3種細(xì)胞出現(xiàn)的時間一樣。

在成脂誘導(dǎo)分化液分化后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。AD-MSC在分化第11天出現(xiàn)脂滴；BM-MSC第15天出現(xiàn)脂滴；UC-MSC和AM-MSC第23天出現(xiàn)脂滴，但脂滴較小，成脂率不高。經(jīng)油紅O染色液染色后，可以看到細(xì)胞中的脂滴被染成深鮮紅色（圖4）。

圖2 四種不同來源MSC的P3、P6和P9的生長曲線

3 討論

MSC是來自胚胎早期發(fā)育的中胚層，存在于許多組織器官，具有很強(qiáng)自我更新和分化能力，既有向骨、軟骨、脂肪和肌肉等中胚層組織細(xì)胞分化的潛能，也有分化為外胚層的細(xì)胞和內(nèi)胚層細(xì)胞的能力［5-6］。研究表明，MSC除了具有自我更新和分化的能力，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、分泌多種細(xì)胞因子、抗凋亡及促增殖等作用，在修復(fù)損傷、調(diào)節(jié)免疫、減緩器官衰老、治療退行性疾病及支持造血系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用，在各種疾病的預(yù)防和治療中具有較廣闊的應(yīng)用前景［7-9］。隨著組織工程的發(fā)展，MSC移植治療也逐漸成為治療疾病的一種新方式、新手段。但MSC的體外分離培養(yǎng)及大量擴(kuò)增是臨床應(yīng)用的前提。因此，本文就貓不同來源的MSC的分離培養(yǎng)方法、細(xì)胞生長特性、多向分化性和細(xì)胞表型進(jìn)行了研究。

圖3 四種不同來源MSC表面標(biāo)記鑒定結(jié)果

表2 四種不同來源MSC表面標(biāo)記表達(dá)率

圖4 四種不同來源MSC的成骨、成脂分化結(jié)果（標(biāo)尺=100 μm）

MSC擁有諸多優(yōu)點，可以成為細(xì)胞治療的種子，但是如何獲得更多、更純、活性更好的細(xì)胞依然是研究的熱點。目前，MSC的分離方法有：免疫磁珠分選法、密度梯度分選法、全骨髓貼壁法、組織消化法等［10］。本研究中，骨髓的分離采用了全血培養(yǎng)法，可以減少分離液等因素對細(xì)胞的傷害；其他3種細(xì)胞均采用Ⅰ型膠原酶消化法，膠原酶消化比較溫和，可減少對細(xì)胞的傷害，為后續(xù)細(xì)胞的培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究提供保障。對細(xì)胞生長特性分析，幾種細(xì)胞的生長形態(tài)相近，以多邊形、梭形等不規(guī)則圖形貼壁生長，與報道的結(jié)果一致［11-13］。通過繪制生長曲線發(fā)現(xiàn)，AD-MSC的活性最好，增長速度最快，群體倍增時間最短，但隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞的增長速度有所下降；BM-MSC的活性和增長速度次之；通過原代、傳代培養(yǎng)及細(xì)胞生長曲線比較，我們發(fā)現(xiàn)AM-MSC和UC-MSC的細(xì)胞活性較差，細(xì)胞胞質(zhì)相對較大，折光性差。同ADMSC和BM-MSC相比，這些可能就是這兩種細(xì)胞數(shù)較少，倍增時間較長的原因。本研究發(fā)現(xiàn)AD-MSC的增長活性在P3代時最好，細(xì)胞傳至P9的時候仍保持良好增殖活性。有研究表明，體外培養(yǎng)MSC細(xì)胞可傳至P20代以上，因此MSC可以在體外大量的擴(kuò)增培養(yǎng)，可以為臨床研究應(yīng)用提供足量的細(xì)胞［14］。

MSC是一種分化潛能較高的中胚層細(xì)胞，對MSC的分化潛能研究主要是成骨、成脂和成軟骨分化能力［15］。我們研究發(fā)現(xiàn)，不同組織來源的MSC的分化潛能也存在一定差異，AD-MSC和BM-MSC的成骨成脂出現(xiàn)時間較短；AM-MSC和UC-MSC成脂分化時間較長而且成脂率不高。這些結(jié)果提示，AD-MSC和BM-MSC的成骨成脂分化能力較強(qiáng)。除此之外，根據(jù)報道，不同來源的MSC表型存在很高的相似性，如表達(dá)CD29、CD44、CD 73、CD 90和CD 105等，不表達(dá)或弱表達(dá)CD 14、CD 34和CD 45［16-18］。本研究對細(xì)胞表面分子 CD44、CD90、CD105和CD34進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的4種MSC均能表達(dá)CD44、CD90、CD105，低表達(dá)CD34，該結(jié)果與報道的研究結(jié)果相一致［3-4，11，17］。盡管貓AD-MSC在生長能力和分化潛能上有著比其他組織來源的強(qiáng)，但其臨床應(yīng)用的優(yōu)勢怎樣，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實驗建立貓的臍帶、羊膜、骨髓和脂肪來源的MSC的分離培養(yǎng)體系，并獲得了具有有貼壁生長特性以及分化為成脂成骨的能力和細(xì)胞表面高表達(dá)CD105、CD90、CD44 3種細(xì)胞表面標(biāo)志物，低表達(dá)CD34的MSC。4種細(xì)胞中，AD-MSC的增長活性最好，細(xì)胞傳至第9代的時候依然保持良好的增殖活性，提示AD-MSC的臨床應(yīng)用可能比較好。