小桐子低溫脅迫下microRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參的篩選與比較

孔春艷 陳永坤 王莎莎 郝大海 楊宇 龔明

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

microRNA（miRNA）是一類大小為20-24 nt、具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA。眾多的miRNA參與了植物對(duì)低溫的感受、響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)過(guò)程［1-2］。在miRNA研究中，通常需要對(duì)miRNA在植物各組織和器官中的表達(dá)量進(jìn)行分析，確定miRNA表達(dá)量對(duì)于探究miRNA的生物學(xué)功能尤其重要［3-4］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)具有高靈敏性、特異性、快速簡(jiǎn)單、低樣本濃度需求等優(yōu)點(diǎn)，是研究基因表達(dá)的首選方法［1-2，5］。然而，qRT-PCR結(jié)果中基因表達(dá)量的精確和準(zhǔn)確性分析依賴于所選擇的內(nèi)參基因［6］。在qRT-PCR中，最常用的植物內(nèi)參基因包括肌動(dòng)蛋白（ACT）、甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、18S核糖體RNA（18S）和F-BOX家族蛋白（FP），但在miRNA定量檢測(cè)中并不選擇這些內(nèi)參基因［7-8］。研究表明當(dāng)選用ACT作為miRNA研究的內(nèi)參時(shí)，由于目的miRNA與ACT的大小有較大的差異，在校正miRNA數(shù)據(jù)時(shí)并不理想［9］。不經(jīng)篩選直接使用常見(jiàn)內(nèi)參基因會(huì)降低試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［10-12］。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性差導(dǎo)致基因表達(dá)量檢測(cè)的誤差，如在研究雜交蘭（Cymbidium hybrid）花器官不同部位中八氫番茄紅素脫氫酶基因（ChPDS）的表達(dá)模式時(shí)，以雜交蘭泛素蛋白基因（ChUBQ）、雜交蘭延伸因子基因（ChEF-1α）、雜交蘭微管蛋白基因（ChTUB）、雜交蘭肌動(dòng)蛋白基因（ChACT）及雜交蘭泛素蛋白基因（ChUBQ）和雜交蘭延伸因子基因（ChEF-1α）組合進(jìn)行校正的雜交蘭ChPDS表達(dá)模式均為花瓣＞唇瓣＞蕊柱，而以穩(wěn)定性最差的雜交蘭RNA聚合酶β亞基基因（ChrpoB）進(jìn)行校正時(shí)，雜交蘭ChPDS相對(duì)表達(dá)量為花瓣＞蕊柱＞唇瓣［13］。因此，針對(duì)實(shí)際情況篩選內(nèi)參基因很有必要性［1-2，5］。

小桐子（Jatropha curcas）是一種有巨大綜合開(kāi)發(fā)潛力的多用途能源植物樹(shù)種，原產(chǎn)熱帶及亞熱帶地區(qū)，抗寒性較弱，是一種喜溫冷敏植物［14-16］。Maes等［17］進(jìn)行的世界范圍內(nèi)的調(diào)查表明，小桐子生長(zhǎng)適宜的年均溫度為19.3-27.2℃，最低月均溫度要高于10.5℃。而隨著小桐子栽培的北移和向高海拔山區(qū)發(fā)展，低溫冷害已成為限制小桐子產(chǎn)業(yè)的主要環(huán)境因素［15-17］。為研究miRNA在小桐子低溫脅迫與適應(yīng)過(guò)程中的調(diào)控作用，本課題組前期進(jìn)行了小桐子小RNA-seq分析，初步獲得了差異表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)的miRNA信息［18］，但要進(jìn)行進(jìn)一步qRTPCR驗(yàn)證，需要篩選合適的內(nèi)參基因用于miRNA定量分析。但目前尚未見(jiàn)對(duì)小桐子miRNA qRT-PCR內(nèi)參基因篩選的報(bào)道。

本研究基于小桐子小RNA-seq數(shù)據(jù)［18］，篩選低溫處理前后表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的10個(gè)miRNA以及在其他物種miRNA定量分析中常用的U6作為候選內(nèi)參，采用qRT-PCR方法對(duì)候選內(nèi)參基因在低溫脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期篩選出可用于小桐子低溫脅迫下miRNA差異表達(dá)分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因，為小桐子miRNA表達(dá)的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取飽滿的小桐子種子，參照李忠光等［19］方法，用1.5% CuSO4溶液消毒，在恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d，將發(fā)芽的種子種在營(yíng)養(yǎng)土中，在相對(duì)濕度75%、26/20℃、16/8 h光周期的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，至第3片真葉展開(kāi)［20］。

1.1.2 低溫處理 在小桐子長(zhǎng)至第3片真葉展開(kāi)時(shí)，轉(zhuǎn)入1℃光照培養(yǎng)箱中低溫處理5 d，每天取樣1次（LT1d-LT5d，取用第2片及以上展開(kāi)真葉）。以未處理的小桐子作為對(duì)照1（C0d）；另在正常培養(yǎng)條件下第26天取樣作為對(duì)照2（C5d）。依據(jù)前期結(jié)果，在1℃處理5 d時(shí)，小桐子幼苗死亡率約70%［20-21］。

1.2 方法

1.2.1 樣品miRNA提取及cDNA合成 參照Plant miRNA Kit（OMEGA公司）說(shuō)明書(shū)提取miRNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)miRNA的質(zhì)量，NanoPhotometer-N60超微量分光光度儀（Implen，Germany）測(cè)定濃度，并通過(guò)OD260/OD280和OD260/OD230檢測(cè)miRNA的純度。采用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（Tiangen，北京）反轉(zhuǎn) 錄 cDNA。 反 應(yīng) 體 系 為 Reaction Buffer 10 μL、Enzyme Mix 2 μL、miRNA 2 μL，加水至 20 μL。42℃孵育1 h，并在95℃加熱3 min失活逆轉(zhuǎn)錄酶（RT enzyme mix），進(jìn)行miRNA加A尾反應(yīng)以及cDNA第一鏈合成。cDNA用NanoPhotometer-N60超微量分光光度儀（Implen，Germany）測(cè)定濃度，每份樣本終濃度為100 ng/μL，取1 μL用于qRT-PCR。

1.2.2 qRT-PCR各供選基因引物設(shè)計(jì) 在11個(gè)候選內(nèi)參基因中，U6snRNA序列來(lái)自于Jatropha curcas Database（JCDB）和NCBI；10個(gè)來(lái)自小桐子低溫脅迫下小RNA-seq［18］中表達(dá)穩(wěn)定的miRNA，按照其序列設(shè)計(jì)引物，反向引物為：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′。 利 用 DNAMAN 8（Lynnon，USA）進(jìn)行引物互補(bǔ)檢測(cè)，減少引物自身延伸或兩兩互補(bǔ)延伸形成二聚體的可能性（表1）。

表1 候選內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 qRT-PCR分析 根據(jù)TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H PLUS）試劑盒說(shuō)明書(shū)配置10 μL反應(yīng)體系，cDNA模板1 μL（10 ng/μL）、正反向引物各 0.4 μL（10 μmol/L）、2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix 5 μL 和 ddH2O 3.2 μL。所有操作均在冰上進(jìn)行，3個(gè)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)，并在65-97℃進(jìn)行熔解曲線分析。利用LightCycler?96 System（Roche，Switzerland）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 記錄qRT-PCR分析得出的基因轉(zhuǎn)錄水平Ct值，每個(gè)基因在不同處理樣本中的Ct值測(cè)定3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR熔解曲線利用LightCycler 96 SW 1.1（Roche，Switzerland）軟件進(jìn)行作圖及分析；利用 geNorm（https：//genorm.cmgg.be/）、NormFinder（https：//www.moma.dk/normfinder-software/） 和BestKeeper（https：//www.gene-quantification.de/bestkeeper.html）分析11個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性；利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 miRNA質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的miRNA樣品（圖1）?？梢?jiàn)提取的miRNA質(zhì)量較好；各樣品中miRNA的OD260/OD280、OD260/OD230的值均大于1.8（表2），miRNA質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。

圖1 提取的miRNA2%的瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 7個(gè)miRNA樣品的純度與濃度

圖2 內(nèi)參基因的qRT-PCR分析

2.2 引物擴(kuò)增特異性分析

以miRNA cDNA第一鏈為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2）。11條內(nèi)參基因條帶單一，通過(guò)測(cè)序、比對(duì)等檢測(cè)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，符合預(yù)期結(jié)果。

圖3 十一個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR熔解曲線

經(jīng)熔解曲線分析，11條候選內(nèi)參基因的熔解曲線均呈現(xiàn)明顯的單一峰（圖3），不存在引物二聚體，并且每個(gè)樣本的重復(fù)性較好，進(jìn)一步說(shuō)明引物的特異性，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)分析

11個(gè)候選內(nèi)參基因在不同溫度處理的小桐子葉片中，平均Ct值變化范圍為10.53-26.03（圖4），其中U6Ct值最小，miR2612Ct值最大（圖5）。

圖4 11個(gè)候選內(nèi)參基因平均Ct值分布

圖5 各候選基因在不同處理下葉片組織中Ct值分布

2.4 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

利用GeNorm軟件對(duì)11個(gè)候選內(nèi)參基因在不同處理下葉片組織中穩(wěn)定性（M值）分析（圖6），M 值 由 高 到 低 為miR5672、miR5040、miR5535、miR1446、miR3624、miR5791、miR2612、miR159、miR3630、U6、miR6448，所選候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，表明候選基因表達(dá)都較穩(wěn)定，M值最低的是miR6448；其次是U6?？梢?jiàn)miR6448在低溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定，其次是U6。

通過(guò)對(duì)不同處理下葉片組織中內(nèi)參基因的NormFinder分析（表3），發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定值最小的是miR6448（0.088）；其 次 是U6（0.134）。 這 與GeNorm分析得出的結(jié)果一致。

圖6 不同處理下葉片組織中內(nèi)參基因的GeNorm分析

表3 不同處理下葉片組織中內(nèi)參基因的NormFinder分析

表4 不同處理下葉片組織中內(nèi)參基因的BestKeeper分析

由BestKeeper分析標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，miRNA6448的標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.18）和變異系數(shù)（0.78）都是最小的，表明miRNA6448在低溫脅迫下的小桐子中表達(dá)最穩(wěn)定。

3 討論

進(jìn)行qRT-PCR時(shí)，對(duì)內(nèi)參基因的篩選非常有必要。內(nèi)參基因在qRT-PCR中可以降低或校正基因定量過(guò)程中存在的誤差，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ诨蚨勘磉_(dá)的結(jié)果有重要意義［3，10］。而在選擇內(nèi)參基因時(shí)，除內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，內(nèi)參基因的表達(dá)豐度也會(huì)影響qRT-PCR結(jié)果［13，22-23］。內(nèi)參基因與所檢測(cè)基因之間的Ct值差異越小，擴(kuò)增效率對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響也會(huì)越小，計(jì)算的結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確［23］。如果目標(biāo)基因和內(nèi)參基因表達(dá)量（Ct值）過(guò)大，用內(nèi)參基因來(lái)衡量目標(biāo)基因的表達(dá)量就不完全可靠［10，23］。在本研究中，miR6448的 Ct值為 23左右，豐度適中，可以用于檢測(cè)qRT-PCR試驗(yàn)中豐度較適中的轉(zhuǎn)錄本；U6的Ct值為10左右，可以用于miRNA qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中豐度較高的轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)。

在進(jìn)行miRNA研究時(shí)，提取的miRNA中往往棄除了mRNA等長(zhǎng)鏈RNA，因此，相對(duì)鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的mRNA無(wú)法再用作miRNA定量研究的內(nèi)參［24］。在qRT-PCR中，最常用的植物內(nèi)參基因包括ACT、GAPDH、18S和F-BOX家族蛋白，通常在miRNA定量檢測(cè)中并不選擇這些內(nèi)參基因［7-8］。常用于miRNA熒光定量的內(nèi)參基因多為一些片段長(zhǎng)度相對(duì)較短的基因，例如U6［3，25-26］。在大豆［27］、小麥［28］、龍眼［29］和百合［8］等植物 miRNA 的 qRT-PCR 分析中，miRNA的表達(dá)水平比最常用的ACT、GAPDH、F-BOX等蛋白質(zhì)編碼基因穩(wěn)定得多。

在miRNA的qRT-PCR分析時(shí)，常常需要根據(jù)不同的植物材料和處理?xiàng)l件來(lái)選擇合適的內(nèi)參。茶樹(shù)低溫脅迫下，miRNA（PC-3p-222）在不同低溫處理以及不同茶樹(shù)組織中表達(dá)最為穩(wěn)定，可作為茶樹(shù)低溫脅迫下miRNA的qRT-PCR的內(nèi)參基因［30］。甘蔗芽在低溫脅迫下，miR171/18S rRNA和miR171/miR5059表達(dá)最穩(wěn)定［31］。鹽脅迫下，U6適合作為大豆根組織miRNA研究的內(nèi)參［32］。葡萄在鹽脅迫和低溫脅迫下，U6是表達(dá)最穩(wěn)定的基因［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，小桐子葉片組織對(duì)低溫脅迫處理響應(yīng)的miRNA中，miR6448和U6的表達(dá)表現(xiàn)穩(wěn)定?？梢?jiàn)miRNA內(nèi)參基因除特異性外，像U6這樣的基因也表現(xiàn)出一定的通用性。

4 結(jié)論

低溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的基因是miR6448和U6。miR6448適用于表達(dá)豐度適中的microRNA基因表達(dá)定量分析中；U6適用于豐度較高的microRNA的qRT-PCR分析。