體外藥敏實(shí)驗(yàn)對卵巢癌個(gè)體化化療的療效分析

蘇 丹，何文靜，劉 屹，崔慢慢，謝 蘭，岳 軍

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610072)

在影響女性生存的女性腫瘤中，卵巢癌一直占據(jù)首位，而眾所周知，化療是主要的治療手段之一。因?yàn)榱龅漠愘|(zhì)性特征，即使是組織類型和分化程度相同的腫瘤，對相同化療藥物的敏感程度也不盡相同，是否會耐藥也無法預(yù)知。因此，化療藥物敏感和耐藥試驗(yàn)應(yīng)運(yùn)而生。 其中，三磷酸腺苷法腫瘤化學(xué)敏感檢測(ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA)法被研究得越來越多[1]。 本研究擬采用ATP-TCA藥敏試驗(yàn)法檢測卵巢癌患者腫瘤組織，并與患者化療效果一起分析，探討兩者的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2017年12月在四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科診斷為原發(fā)性上皮性卵巢癌并行手術(shù)治療的患者，收集其手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織行體外藥敏試驗(yàn)，共75例，均獲患者知情同意。另選擇98例手術(shù)后未行藥敏試驗(yàn)但在我科化療的患者作為對照組。兩組患者基本情況見表1。

表1 兩組患者基本情況比較

1.2 材料生物熒光藥物敏感性檢測試劑盒(ATP-chemiluminescence method，ATP-TCA試劑盒)，購自于湖州海創(chuàng)生物科技有限公司。 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的化療藥物如下：紫杉醇(taxol)，購自于太極制藥公司；卡鉑(carboplatin)，購自于齊魯制藥公司；順鉑(cisplatin)，購自于江蘇豪森藥業(yè)公司；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，購自于浙江海正藥業(yè)公司；多西他賽(docetaxel)，購自于江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，購自于天津金耀公司公司；吉西他濱(gemcitabine)，購自于法國禮來公司；拓?fù)涮婵?topotecan)，購自于葛蘭素史克公司。根據(jù)血漿峰值濃度(plasma peak concentration，PPC)確定上述藥物試驗(yàn)濃度，分別為：環(huán)磷酰胺：3 μg/ml、順鉑：6.3 μg/ml、卡鉑：25 μg/ml、多西他賽：10 μg/ml、紫杉醇：13.8 μg/ml、5-氟尿嘧啶：0.9 μg/ml、拓?fù)涮婵担?.14 μg/ml、吉西他濱：25 μg/ml。

1.3 方法ATP-TCA操作步驟根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行：將手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織反復(fù)沖洗，除掉血凝塊及壞死組織等，剪碎、離心、消化后制成濃度為(1～3)×105/ml的細(xì)胞懸液。將其加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)后，加入八種化療藥物。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育5～7天，然后加入ATP提取液，混勻后室溫下靜置15分鐘，依次取0.05 ml混合液置熒光分析儀檢測。每個(gè)藥物設(shè)5個(gè)濃度梯度，依次為2倍PPC、單倍PPC、1/2倍PPC、1/4倍PPC及1/8倍PPC，同時(shí)設(shè)空白孔(不含腫瘤細(xì)胞及藥物)及對照孔(含腫瘤細(xì)胞但不加藥物)?；熕幬锏囊种坡?(1-ATP試驗(yàn)組/ATP對照組)×100%。抑制率≥70%為高度敏感；50%～70%為中度敏感；30%～50%為低度敏感；<30%為耐藥；當(dāng)抑制率≥50%時(shí)可以推薦臨床使用。

1.4 臨床應(yīng)用與評價(jià)根據(jù)藥敏結(jié)果從高至低順序，選擇敏感性高的化療方案進(jìn)行化療6～8個(gè)周期，化療結(jié)束后根據(jù)婦科三合診、腫瘤標(biāo)記物(如CA125等)、B超、CT等情況綜合判定局部腫瘤變化情況。療效評定按世界衛(wèi)生組織(WHO)實(shí)體瘤的評定標(biāo)準(zhǔn)[2]，完全緩解(CR)：腫瘤病灶完全消失；部分緩解(PR)：腫瘤病灶縮小50%；腫瘤穩(wěn)定(SD)：腫瘤病灶無明顯變化；腫瘤進(jìn)展(PD)：腫瘤病灶較前增大。以CR和PR為有效，以SD和PD為無效。隨訪時(shí)間終點(diǎn)為2018年4月，分析指標(biāo)包括無進(jìn)展生存期(PFS)、總生存期(OS)及3年生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATP-TCA法結(jié)果在收集的75例患者中，腫瘤生長抑制率試驗(yàn)結(jié)果見圖1和表2。根據(jù)上述藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可以得出上述常見化療藥物中高度敏感組和中度敏感組比例分別為45.2%和16.7%。在單倍PPC時(shí)將不同化療藥物的腫瘤抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并按從高到低的順序進(jìn)行排列，見表3。本試驗(yàn)中環(huán)磷酰胺+順鉑、5-氟尿嘧啶+順鉑及拓?fù)涮婵?卡鉑等3組化療藥對體外卵巢癌細(xì)胞生長無效，而其余5組化療藥則具有抑制作用。將不同化療藥物中、 高度敏感組例數(shù)占總例數(shù)(n=75)百分比進(jìn)行排列，結(jié)果見表2第3、4行。結(jié)果顯示：紫杉醇+卡鉑、紫杉醇+順鉑、多西他賽+卡鉑的中、高度敏感組比例最高，其次是吉西他濱+順鉑和伊立替康+卡鉑組，然而環(huán)磷酰胺+順鉑、5-氟尿嘧啶+順鉑和拓?fù)涮婵?卡鉑低度敏感比例低于50%，不推薦臨床使用。

圖1 8組化療藥物對75例卵巢癌標(biāo)本的抑制例數(shù)分布圖

表2 8種化療藥物對75例卵巢癌標(biāo)本的抑制例數(shù) (n)

表3 ATP-TCA法檢測的藥物中+高敏感組所占比例

2.2 近期療效評價(jià)由表4可見，近期臨床治療有效率77.33%，對照組則為72.45%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.213，P< 0.05)，說明根據(jù)藥敏試驗(yàn)選擇治療方案可獲得較高近期治療有效率。

表4 近期臨床治療效果

2.3 遠(yuǎn)期療效比較結(jié)果顯示，藥敏組的PFS與OS均較對照組明顯延長；藥敏組患者3年生存率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見表5及圖2。

表5 兩組患者生存期與生存率比較

圖2 兩組患者PFS期與OS期比較

3 討論

卵巢癌是影響我國女性生存的第二大惡性腫瘤，隨著診治方式的不斷進(jìn)步，手術(shù)治療聯(lián)合化療已能大大提高卵巢癌患者的生存率，但仍有很大一部分患者在術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)[3]。化療是卵巢癌綜合治療中的主要組成部分之一，但根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化療方案給患者提供治療時(shí)，由于患者體內(nèi)藥物代謝酶的遺傳性及腫瘤的異質(zhì)性不同，使患者個(gè)體對不同化療藥物的敏感性存在差異，甚至部分患者不能獲得臨床緩解，而另一部分患者可能因?yàn)閲?yán)重的毒副反應(yīng)不能完成療程[4]?；熕幬锩舾泻湍退幵囼?yàn)(chemotherapy sensitivity and resistance assays，CSRA)因此產(chǎn)生。美國國家綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)在近期的卵巢癌治療指南中指出，腫瘤中心有多種化療藥物時(shí)，如果條件允許，可參照腫瘤藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇具體化療方案[5]。

根據(jù)試驗(yàn)技術(shù)的不同，體外腫瘤藥敏試驗(yàn)可分為四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法、 ATP-TCA法、 ChemoFx法、極端耐藥試驗(yàn)法、細(xì)胞毒性差異染色方法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、立體組織培養(yǎng)法等[6]。MTT 實(shí)驗(yàn)室使用較多，但結(jié)果與臨床一致性差。ATP-TCA法敏感性高，所需腫瘤細(xì)胞數(shù)極少，最低僅需20～250個(gè)細(xì)胞，并且其簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、臨床符合率較高，從而成為關(guān)注的熱點(diǎn)，且已有相關(guān)試劑盒上市，可以在臨床上廣泛推廣。但該法不能區(qū)別非腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，可能導(dǎo)致誤差，因此收集到的腫瘤組織最好經(jīng)過修剪，去除血管、壞死組織等預(yù)處理[7]。ChemoFx檢測法則可以排除非腫瘤細(xì)胞的影響，但此試驗(yàn)需要培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞2～3周，耗時(shí)較長[8]。實(shí)際上，腫瘤在體內(nèi)生長還依賴于周圍的血液供應(yīng)及細(xì)胞間的相互作用，因此產(chǎn)生了立體組織培養(yǎng)法[9]。其將單層細(xì)胞培養(yǎng)改為組織塊或多細(xì)胞球體培養(yǎng)，可以更好地模擬實(shí)體瘤體內(nèi)生長環(huán)境，更接近于臨床。但該種方法技術(shù)難度大，重復(fù)性和穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高。因此從可重復(fù)性及經(jīng)濟(jì)實(shí)效性等出發(fā)，本實(shí)驗(yàn)選擇了ATP-TCA法。

本研究采用ATP-TCA法對75例卵巢上皮性癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，而本試驗(yàn)藥敏組和對照組的治療近期有效率分別為77.33%及 72.45%，PFS分別是20.72月及18.84月，中位生存期分別是32.30月及29.03月，3年生存率分別是54%及46%，結(jié)果顯示根據(jù)化療藥敏試驗(yàn)選擇的化療方案可獲得較高的臨床有效率。崔穎等[10]收集88例卵巢癌進(jìn)行ATP-TCA體外藥敏試驗(yàn)，并設(shè)立對照組，結(jié)果顯示藥敏組患者的治療近期有效率高于對照組，其值分別為85.23%及68.75%。而本實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)組和對照組的治療近期有效率分別為77.33%及 72.45%，與上述報(bào)道結(jié)果相近。

目前，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)和 NCCN等多家國際權(quán)威機(jī)構(gòu)和大多數(shù)婦科腫瘤中心將紫杉醇和鉑類(TP)聯(lián)合方案確定為卵巢上皮性癌的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案[5]。本試驗(yàn)結(jié)果也提示PPC下紫杉醇+卡鉑的腫瘤生長抑制率最高。Zhang等[7]的體外藥敏結(jié)果顯示：單藥方案中敏感性最強(qiáng)的為紫杉醇(82.5%)，卡鉑(58.8%)次之；聯(lián)合用藥敏感性較單藥方案增加。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示化療敏感性由高到低依次為：紫杉醇+卡鉑>紫杉醇+順鉑>多西他賽+卡鉑>吉西他濱+順鉑>伊立替康+卡鉑>環(huán)磷酰胺+順鉑>5-氟尿嘧啶+順鉑>拓?fù)涮婵?卡鉑，兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果相近。因此，藥敏試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)紫杉醇+卡鉑為卵巢上皮性腫瘤的一線化療方案。另外，F(xiàn)ruehauf等[11]認(rèn)為，即使證實(shí)為卵巢上皮性腫瘤患者，也可以對其進(jìn)行紫杉醇、鉑類等一線藥物的體外藥敏實(shí)驗(yàn)來篩選出可能耐藥者。腫瘤學(xué)家可能據(jù)此略過這些不敏感的藥物選用其它的治療方案，從而使耐藥患者免于不必要的化療及由此帶來的副作用及金錢浪費(fèi)，為患者爭取寶貴的治療時(shí)間，最終使患者從中獲益。究其原因可能在于如果腫瘤細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)這種盡量使藥效達(dá)到最佳的環(huán)境中已經(jīng)表現(xiàn)出完全耐藥，那么體內(nèi)環(huán)境中由于各種因素的影響可能降低化療藥物療效，如腫瘤過大導(dǎo)致血供不良、藥物代謝酶降解藥物等，甚至可能治療失敗。因此認(rèn)為體外藥敏試驗(yàn)的陰性預(yù)測值，即對治療失敗或不敏感的預(yù)測準(zhǔn)確性更高。

因此，體外藥物敏感試驗(yàn)可以協(xié)助腫瘤醫(yī)生提前了解不同患者對不同化療藥物的敏感性，并據(jù)此篩選出對患者更有益的藥物，制定出個(gè)體化的化療方案，減少時(shí)間和金錢的浪費(fèi)，提高患者生存率。但是體外實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬出體內(nèi)環(huán)境，因此體外實(shí)驗(yàn)與實(shí)際臨床效果間的關(guān)系，仍需要進(jìn)行大量的研究。