利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良水稻稻瘟病抗性

徐鵬 王宏 涂燃冉 劉群恩 吳瑋勛 傅秀民 曹立勇 沈希宏

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良水稻稻瘟病抗性

徐鵬 王宏 涂燃冉 劉群恩 吳瑋勛 傅秀民 曹立勇 沈希宏*

(中國水稻研究所/浙江省超級稻研究重點實驗室/水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 311401;*通訊聯(lián)系人, E-mail: xihongshen@126.com)

【】CRISPR/Cas9基因編輯技術是作物遺傳改良的有效工具。本研究通過對水稻、和稻瘟病相關基因進行定點編輯，以期獲得能夠穩(wěn)定遺傳的抗稻瘟病水稻材料?！尽坷肅RISPR/Cas9基因編輯技術，以、和為靶基因，構建共編輯載體pC1300-2×35S::Cas9-g-g-g，用農(nóng)桿菌轉化長粒粳稻恢復系L1014，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的純合突變體用于稻瘟病抗性鑒定。在T0代轉基因株系中，、和突變頻率分別為75%、85%和65%，突變基因型多為雙等位突變。篩選到的不含T-DNA成分的T1代能夠穩(wěn)定遺傳給T2代，并從中獲得單突變純合株系及、和的三突變純合株系。稻瘟病抗性鑒定結果表明，與野生型相比，突變株系的抗性顯著提高。同時，接種后純合突變體株系內(nèi)水楊酸、茉莉酸和乙烯等信號轉導途徑相關基因的表達量均上調(diào)。據(jù)此，我們推測純合突變株系對稻瘟病的抗性增強可能與其對稻瘟病菌的響應被激活有關。利用CRISPR/Cas9技術獲得了能夠穩(wěn)定遺傳和具有較高稻瘟病抗性的純合突變株系，為水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。

水稻；CRISPR/Cas9；；；；稻瘟病抗性

水稻是世界上食用人口最多的農(nóng)作物。水稻產(chǎn)量每年都會受制于稻瘟病的暴發(fā)，稻瘟病嚴重時甚至導致顆粒無收，制約了水稻生產(chǎn)的發(fā)展。因此，提高稻瘟病抗性以減少水稻產(chǎn)量損失對于緩解日益增加的世界人口壓力顯得尤為重要[1]，在生產(chǎn)實踐中常使用化學農(nóng)藥和抗性品種來控制稻瘟病的發(fā)生[2]，但兩者的弊端日益顯現(xiàn)。一方面，農(nóng)藥的使用，既污染了環(huán)境又增加了生產(chǎn)成本；另一方面，水稻稻瘟病是由子囊菌[(Hebert) Barr，無性世代為(Cooke) Sacc.]引起的真菌性病害，且稻瘟菌生理小種具有高度變異的潛力，其新基因型的產(chǎn)生勢必降低了對水稻品種中抗性基因的敏感度[2]，田間優(yōu)勢生理小種出現(xiàn)，優(yōu)良抗性品種往往種植3~5年后其抗性會逐漸喪失[3]。在水稻育種上，結合分子標記輔助技術，通過雜交、回交方式能夠將多個抗性基因聚合到同一品種中來彌補單一抗性基因抗性的弱化，但該育種過程周期較長，在將目標基因導入時難以避免連鎖累贅，造成育種效率較低。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)[4-7]是近年來發(fā)展較為迅速、操作簡便及成本低而被廣泛應用的基因編輯技術。該技術原理是借助gRNA與目標序列的特異性識別，引導Cas9核酸酶在靶位點切割DNA使之雙鏈斷裂[8]，進而激發(fā)胞內(nèi)DNA修復系統(tǒng)進行同源重組和非同源重組修復時引起的堿基特異突變（堿基插入、缺失和替換）[7]。近年來，利用該系統(tǒng)已經(jīng)對水稻[9-12]、擬南芥[12-14]、小麥[10,12,15-16]等不同物種進行了相關性狀的遺傳改良。Xie等[4]通過定向編輯水稻基因來改良水稻對病原菌的抗性；Shen等[17]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時敲除8個水稻性狀相關基因，獲得了眾多不同基因組合的突變體；Fei等[18]通過定向基因降低直鏈淀粉含量來改良稻米品質(zhì)。CRISPR/Cas9技術能夠在育種過程中迅速得到安全、穩(wěn)定遺傳的純和突變，從而在植物基因組編輯中得到廣泛的應用。

前人研究表明，是一個隱性抗稻瘟基因位點[19]，產(chǎn)物富含脯氨酸，包含重金屬結合結構域和蛋白互作結構域，其抗性的產(chǎn)生是抗性品種的基因在富脯氨酸區(qū)分別有21 bp和48 bp的缺失[20]。是一個AP2/ERF類轉錄因子，受稻瘟病菌誘導而負調(diào)控稻瘟病菌的抗性[21]?；蚓幋a928個氨基酸，其抗感差異的產(chǎn)生是由于第918位的丙氨酸到絲氨酸的變化[22]，且基因介導的抗性必須有(t)的特異性信號識別發(fā)揮作用[23]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對長粒粳稻恢復系L1014中、和為靶基因進行定點編輯，進而獲得有利用價值的純合突變體，為水稻稻瘟病抗性育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與載體

轉基因受體材料長粒粳稻恢復系L1014及其T0轉基因植株于2017年夏季種植在中國水稻研究所轉基因試驗基地，常規(guī)水肥管理，T1植株于冬季種植在溫室。表達載體pC1300-Cas9和SK-gRNA中間載體由中國水稻研究所王克劍實驗室提供。

1.2 gRNA靶位點設計

利用CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi- bin/CRISPR)進行gRNA靶位點的設計，選擇得分較高且靠近ATG起始位點的引物序列，分在和的第1外顯子上設計19 bp的靶位點序列且其PAM序列為NGG(圖1)。其中，3個靶位點的設計都靠近ATG起始密碼子，以便更容易造成目標基因的功能喪失。最后利用NCBI對水稻基因組進行BLAST來分析確認靶位點的特異性。

1.3 CRISPR/Cas9表達載體的構建

根據(jù)靶位點序列，分別合成引物-g-F/- g-R、-g-F/-g-R和-g-F-g-R (表1)，然后等量混合變性退火形成具有黏性末端的片段。利用Ⅰ(Ferment公司)酶切SK-gRNA中間載體，用T4連接酶將、和接頭和被Ⅰ酶切回收的SK-gRNA線性載體進行連接，轉化大腸桿菌，通過測序(杭州擎科梓熙生物技術有限公司)挑選出正確的連接載體。分別用Ⅰ/Ⅰ、Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅱ酶切SK-gRNA-、SK-gRNA-和SK-gRNA-三個中間載體獲得目的片段，同時用Ⅰ/HⅠ酶切pC1300- Cas9載體，再利用T4連接酶連接酶切產(chǎn)物構建成pC1300-2×35S::Cas9-g-g-g表達載體，通過測序確定正確的表達載體(圖2)，最終利用農(nóng)桿菌轉化受體材料獲得轉基因T0植株。

帶下劃線的字母為起始密碼子，加粗字母為PAM序列。

Fig. 1. Schematic diagram of the targeted sites inand.

表1 本研究所用引物

圖2 表達載體構建流程

Fig. 2. Flow diagram of the expression vector construction.

1.4 T0代陽性株的獲得及靶位點檢測

用農(nóng)桿菌株轉化受體材料長粒粳稻L1014獲得T0植株。剪取T0植株葉片利用CTAB方法提取基因組DNA。分別在、和靶序列兩側設計擴增引物(表1)來擴增T0陽性植株的目的條帶，將PCR產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序，以L1014基因組序列作為參照。測序出現(xiàn)單峰則為野生型或純合突變，再通過與野生型序列比對確定；測序出現(xiàn)雙峰，利用在線軟件DSDecode進行序列解碼。

1.5 T1代無轉基因成分篩選

利用載體特異引物對F/R和Cas9F/Cas9-R擴增突變植株基因組序列，兩對引物均擴增不出條帶的為無轉基因成分的突變植株。

1.6 稻瘟病菌的培養(yǎng)及孢子液的配制

在超凈工作臺內(nèi)將從?20℃冰箱取出的帶有稻瘟菌生理小種18-6-5(本實驗室保存)的紙片放置在燕麥培養(yǎng)基上，把培養(yǎng)基倒置放進霉菌培養(yǎng)箱，25℃~27℃下黑暗培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿，用滅菌的棉簽刮掉菌絲，滅菌水清洗凈菌絲后室溫晾干，然后在培養(yǎng)皿上蓋兩層已滅菌的紗布，蓋緊培養(yǎng)皿，25℃~27℃下光照培養(yǎng)至大量分生孢子產(chǎn)生。

用0.02%的吐溫20洗脫培養(yǎng)好的稻瘟菌分生孢子(可將洗脫的孢子液倒入同一菌種的平板繼續(xù)洗，如此洗脫2~3次)，用滅菌的棉簽輕輕刮下稻瘟菌，然后用滅菌的兩層紗布過濾得到孢子收集液。將孢子液混勻后，在血球計數(shù)板上計數(shù)，把孢子懸浮液調(diào)至2×105個/mL（在10×10倍視野下孢子數(shù)為20~30個）用于稻瘟菌接種備用[20]。

1.7 稻瘟菌噴霧接種

接種前用0.02%的吐溫洗脫液潤洗噴霧瓶，將培養(yǎng)好的水稻幼苗(播種后兩周)放進透明的收納箱內(nèi)，取配制好的孢子溶液斜向上噴向空中使之均勻落在水稻葉片上，盡量使每片葉片上形成霧化的小水滴，噴完后立即用保鮮膜封口并蓋上蓋子。放置于培養(yǎng)箱，保持28℃恒溫，95%恒濕，黑暗培養(yǎng)24 h后恢復正常光照周期，每天對水稻苗進行一次少量噴水以促進發(fā)病，接種7 h后調(diào)查發(fā)病情況。以麗江新團黑谷作為感病對照。

表2 對水稻防衛(wèi)相關基因進行qRT-PCR分析所用的引物

1.8 接種后取樣及防衛(wèi)相關基因的表達量分析

在稻瘟菌接種后的0、12、24 h分別對野生型和突變株系進行混合取樣。在各個取樣時間點對3次重復接種的幼苗隨機取樣5片左右(每個株系水稻幼苗的倒1葉)，迅速置于液氮中，?80℃下保存。

利用植物總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Plant Kit)提取樣品總RNA，用反轉試劑盒(ReverTra Aceq PCR RT Master Mix with gDNA Remover，ToYoBo，日本)進行第1鏈cDNA合成，反應體系和反應條件參照說明書。熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)擴增程序如下：95℃下預變性30 s；95℃下變性5 s，58℃下30 s，72℃下15 s，共35個循環(huán)，定量PCR引物見表2。以(登錄號為LOC_Os03g08020)作為內(nèi)參基因，用2???法進行基因相對表達量的計算。

2 結果與分析

2.1 T0轉基因陽性株的獲得

將攜帶3個靶點的表達載體pC1300-2×35S:: Cas9-g-g-g通過農(nóng)桿菌轉化受體材料L1014以獲取T0轉基因株系。用載體特異引物F/R和Cas9F/Cas9-R檢測轉基因苗中T-DNA區(qū)以篩選轉基因陽性株系。結果表明，21株T0轉基因苗中有20株陽性苗，陽性率達95.2%。

2.2 靶位點突變情況分析

為了分析L1014中、和的突變情況，用靶點檢測引物分別擴增三個靶序列的上下游，將PCR產(chǎn)物進行測序分析。測序結果表明，有15株陽性苗在靶位點位置發(fā)生了突變，突變頻率為75%；有17株陽性苗在靶點發(fā)生突變，突變頻率為85%；有13株陽性苗在靶點發(fā)生突變，突變頻率為65%。其中，突變基因型包括純和突變、雙等位突變，突變類型包括堿基插入和缺失，以堿基插入為主(73.5%)；突變基因型包括純合突變、雜合突變和雙等位突變，突變類型包括堿基的插入、缺失和替換，其中以堿基缺失為主，突變頻率高達85.3%；突變基因型包括純合突變、雜合突變和雙等位突變，突變類型包括堿基的插入、缺失、替換及同時替換缺失(表3)。

2.3 無轉基因成分的純合突變株的獲得

為獲得純合突變植株且不含T-DNA轉基因成分，將T0代陽性株自交繁殖下一代構成T1代突變?nèi)后w。提取T1代植株DNA樣品，用載體特異引物F/R和Cas9F/Cas9-R擴增T1代突變體基因組序列，兩對引物不能同時擴增出615 bp和600 bp的DNA片段的植株即不含轉基因成分的突變株(圖3為部分T1植株的鑒定)。結果篩選出2種單基因突變和1種和三基因突變不含有T-DNA成分，純合突變類型見圖4。利用靶點檢測引物分別擴增無突變植株的靶位點上下游DNA序列。PCR產(chǎn)物測序表明，T1代突變體靶位點突變情況與T0代是一致的，說明這2種單基因突類型和1種和三基因突類型在剔除Cas9載體骨架后是能夠穩(wěn)定遺傳的。把以上三種純合突變體通過自交構建T2代純合突變株系，分別命名為D2101、D2102和D0301。隨后對這三種純合突變系進行接種鑒定。

表3 T0突變體突變基因型和突變類型頻率

M?DNA標記; 1?雙蒸水; 2?野生型; 3?陽性對照; 4～24?T1突變單株; P1?引物Hyg-F和Hyg-R; P2?引物Cas9-F和Cas9-R。

Fig. 3. Screening of transgenic-free mutant plantsby PCR in T1.

Fig. 4. Three mutation types of homozygotes in T2.

2.4 純合突變系編輯基因的qRT-PCR檢測及氨基酸序列分析

對上述純合D2101、D2102和D0301突變系的、和進行qRT-PCR檢測，并分析其相對表達量(圖5)。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達量相對于野生型無顯著變化，在D0301三基因純合突變株系的表達量卻顯著低于野生型。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達量極顯著低于在野生型的表達，與野生型相比，在D0301三基因純合突變株系的表達量顯著降低。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達量趨勢類似于，即在單基因突變株系中的表達量與野生型相比沒有顯著的改變，而在D0301三基因純合突變株系中，其相對表達量極顯著低于野生型。說明、和三個基因在被Cas9系統(tǒng)靶向編輯后，其轉錄水平可能受到影響，RNA可能在體內(nèi)發(fā)生部分降解。

*和**分別表示野生型與純合突變體的差異達0.05和0.01顯著水平(t檢驗)。

Fig. 5. Expression analyses of,andin homozygous mutant plants.

A為D2101和D2102純合突變株系中Pi21氨基酸序列的比對；B, C和D分別為D0301純合突變株系中Pita、Pi21和ERF922的氨基酸序列比對。

Fig. 6.,andgeneamino acid sequences in homozygous mutant lines and the wild type.

同時，對D2101和D2102純合突變株系的基因及D0301純合突變株系的、和基因編碼蛋白的氨基酸序列進行比對分析(圖6)。由于靶位點設計在目的基因ATG起始密碼子附近，經(jīng)過基因編輯后，靶位點序列出現(xiàn)堿基的插入和缺失，導致蛋白的翻譯提前終止，從而影響蛋白的完整性。表明基因編輯不但能最終影響蛋白的水平，對基因的轉錄水平可能也存在一定的影響。

2.5 純合突變株系的稻瘟病抗性鑒定

為了鑒定CRISPR/Cas9基因編輯技術創(chuàng)制的純合突變株系對稻瘟病菌的抗性，我們選擇單基因突變的兩種不同突變類型(D2101在第1外顯子有1 bp缺失，D2102在第1外顯子缺失4 bp)以及、和三基因突變的一種突變類型用來接種鑒定。對3種不同突變類型的T2代純和突變株系于苗期用噴霧法接種稻瘟菌生理小種18-6-5，接種7 d后對病斑葉片進行拍照并統(tǒng)計病斑面積(圖7)。從圖中可以看出，野生型葉片侵染較為嚴重，有明顯的病斑并有所擴散，而純和突變株的病斑明顯小于野生型，只是侵入葉片形成病斑而未進一步擴散。對病斑面積進一步量化時，純合突變株系的相對病斑面積跟野生型存在顯著差異。以上結果表明，純合突變株系在一定程度上提高了對稻瘟菌生理小種18-6-5的抗性，但是否對其他稻瘟菌生理小種產(chǎn)生抗性，仍需進一步的接種鑒定。

2.5 基因編輯株系的防衛(wèi)相關基因表達量分析

植物響應病原菌侵入時，體內(nèi)會激發(fā)一系列病程相關基因的表達來抵御病原菌的擴散。野生型和純合突變株系的防衛(wèi)相關基因的差異表達結果如圖8和圖9。本研究對SA合成及信號傳導途徑中的、與，JA合成相關基因，乙烯應答轉錄因子等基因進行突變株系的表達差異分析。D2101突變株系的、、基因表達量在接種24 h后較野生型極顯著上調(diào)；D2102突變株系的、、及基因在接種12 h后的表達水平高于野生型，其中的表達量在接種12 h后是野生型的220倍；而的表達水平在D2102突變株系中接種12 h后較野生型顯著下降，接種24 h后卻顯著高于野生型。和在未接種時表達水平已顯著高于野生型，接種12 h和24 h后其表達水平持續(xù)上調(diào)；D0301突變株系的和基因表達模式類似于D2101和D2102單突突變株系，即在未接種時基因產(chǎn)物有所積累，在接種12 h和24 h后其表達產(chǎn)物持續(xù)積累。突變體本身的某些防衛(wèi)相關基因在基因編輯后被激發(fā)表達，另外，與野生型相比，在病原菌侵入水稻時，突變株系中的以上防衛(wèi)相關基因在接種初期(12 h和24 h)表達量更高。

A?純和突變株系和野生型在苗期的接種表型；B?野生型和純合突變株系的相對病斑面積(均值±標準誤，n=3)。柱上不同小寫字母表示野生型與純合株的差異達0.01顯著水平(t檢驗)。LTH?麗江新團黑谷；WT?L1014野生型；D2101和D2102?Pi21純合株系；D0301?Pita、Pi21和ERF922純合株系。

Fig. 7. Identification of homozygous mutant lines and the control varieties after inoculation.

*和**表示野生型和純合株系在接種后同一時期0.05和0.01水平上的差異。

Fig. 8. Relative expression levels of defense-related genes in the wild type (L1014, WT) and the homozygous mutant lines inoculated with(Mean±SE,=3).

*和**表示在接種后同一時期野生型與純合株系的差異達0.05和0.01顯著水平。

Fig. 9. Relative expression level of defense-related genes in the wild type(L1014) and the homozygous mutant line D0301, inoculated with(Mean±SE,=3).

3 討論

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術的發(fā)展和應用正方興未艾，研究者不斷對該系統(tǒng)進行優(yōu)化來提高編輯效率繼而擴大其應用范圍。由于該技術具有操作簡便、成本較低特點，目前被廣泛應用于動物[24, 25]、植物[9, 12, 26, 27]和微生物[28]中。Shen[29]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建了水稻的，和三基因表達載體，分析了基因編輯效率及三個基因的突變情況；隨后利用該系統(tǒng)同時編輯8個水稻相關性狀基因[17]，得到了豐富的突變株系。本研究也表明，該技術在水稻抗性品種改良上是較為有效的育種工具。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對長粒粳稻恢復系L1014進行、和三個稻瘟病抗性相關基因的共編輯，以期得到具有利用價值的純合突變系。在T0代中和三基因的突變頻率分別為75%、85%和65%。突變類型以堿基插入為主(頻率為73.5%)，和突變類型以堿基缺失為主(頻率分別為85.3%和58.8%)，突變基因型以雙等位突變頻率最高(頻率分別為47.1%，58.8%和64.7%)。王芳權等[30]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯水稻基因的兩個靶位點，突變頻率分別為78.57%和92.86%，楊海河等[31]構建的單突突變頻率為86.7%； Wang等[32]對進行基因編輯，其突變類型多為堿基缺失且突變基因型也多為雙等位突變?yōu)橹?。本研究中的突變頻率和的突變情況跟前人研究結果基本一致。我們發(fā)現(xiàn)，的突變往往伴隨著和的突變，三個基因的突變與期望有所偏離，從而趨向于同時發(fā)生突變。因此，該研究中只得到單突和、和三突變這兩種基因型組合。

對獲得的兩種基因組合的純合突變株系進行稻瘟病抗性鑒定，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術產(chǎn)生的單突株系和、和三突變株系在接種稻瘟菌后能夠表現(xiàn)出相應的抗性。在對基因編輯純合株系的防衛(wèi)相關基因表達進行分析時，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變株系的SA、JA和乙烯信號途徑被激活從而引發(fā)防衛(wèi)相關基因的高表達。SA合成相關基因在三突變純合系接種24 h后其表達量顯著上調(diào)，在單突變純合系中，表達量在接種12 h后有所下降，但在接種24 h后表達量顯著增高；SA信號轉導途徑相關基因在D2102單突變純合系和三突變純合系在接種12 h后，表達量迅速達到極顯著水平，而在D2101單突變純合系接種24 h后表達量才達到顯著水平；JA合成相關途徑基因的表達與在單突變純合系的表達模式類似，在三突變純合系接種12 h后表達水平顯著提高，而在接種24 h后表達水平又迅速降低。純合突變株系在未接種時和基因表達水平已顯著高于野生型，在接種后的12 h和24 h后表達更是持續(xù)積累。前人研究報道，基因編碼葡聚糖酶，能夠降解真菌細胞壁[33]，基因為乙烯應答轉錄因子，與RACK1互作參與水稻先天免疫反應[34]。這些基因在接種前后表達量的變化能夠促使植物快速的響應和抵御病原菌的侵染和擴散。是個顯性抗性基因，具有稻瘟病菌的生理小種特異性，其抗性由所介導[23]，而和介導的抗性屬于基礎抗性，具有抗譜廣和持續(xù)時間長的特點。本研究中、和三突變純合系也能產(chǎn)生相應的抗性，可能是和介導的基礎抗性效應在起主要作用。根據(jù)Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)，不僅是發(fā)揮抗性功能所需，其本身也能對更多的生理小種產(chǎn)生抗性，包括識別的生理小種，植物長期進化過程中產(chǎn)生多種抗性機制來適應病原菌的侵染，、和三突純合系產(chǎn)生相應的抗性也可能是功能喪失后，由來彌補病原菌入侵帶來的損害。

謝辭：感謝中國水稻研究所王克劍老師提供SK-gRNA中間載體和pC1300-Cas9表達載體。

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Orientation Improvement of Blast Resistance in Rice via CRISPR/Cas9 System

XU Peng, WANG Hong, TU Ranran, LIU Qunen, WU Weixun, FU Xiumin, CAO Liyong, SHEN Xihong*

(,;Corresponding author,:)

【】CRISPR/Cas9 gene editing is an effective biotechnology for crop genetic improvement. This study aims toeditandgenes forobtaining valuable and stable genetic materials with resistance to rice blast. 【】The target genesandwere selected for constructing the pC1300-2×35S::Cas9-g-g-gexpression vector by CRISPR/Cas9 gene editing technology, and transformed by-mediated method into long-grainricerestore lines L1014. Stable genetic mutant lines were selected and their resistance to rice blast was identified.【】 In the T0transgenic lines, the mutation rates ofandwere 75%, 85% and 65%, respectively, and most of the mutant lines are biallelic mutations.The homozygous mutation lines without T-DNA components within the screened T1were selected and transferred to T2stably. Evaluation analysis of resistance to rice blast suggested that the mutant lines showed significantly higher resistance tocompared with the wild type. The expression level of defense-related genes involved in signaling pathways of salicylic acid, jasmonic acid and ethylene metabolisms was up-regulated in the mutant lines compared to the wild type after inoculation of the physiological races of. Therefore, we hypothesized that the increased resistance of homozygous mutant lines to rice blast might be related to the activation of the response to. 【】The homozygous mutant lines with stable inheritance and high blast resistance were obtained by CRISPR/Cas9 system, which would provide ideal materials for improving blast resistance in rice.

rice; CRISPR/Cas9;blast resistance

Q755; S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2019)04-0313-10

10.16819/j.1001-7216.2019.9043

2019-04-10；

2019-05-24。

中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程超級稻育種創(chuàng)新團隊和水稻雜種優(yōu)勢研究機理研究創(chuàng)新團隊資助項目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)；轉基因重大專項(2016ZX08001-002)。