鳳丹花粉活力與柱頭可授性及其繁殖特征研究

羅長維,陳 友,劉 云

(1.重慶城市管理職業(yè)學(xué)院，重慶 401331； 2.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

繁殖成功是植物適應(yīng)環(huán)境變化的集中體現(xiàn)[1-3]。植物繁殖主要包括有性繁殖與無性繁殖，前者是新基因形成和新基因型產(chǎn)生的主要方式，也是大多數(shù)開花植物增加個體數(shù)量的主要方式。確定有性繁殖是否成功的一個主要標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)實率與單果種子數(shù)量的大小，在自然授粉情況下，鳳丹(Paeoniaostii)的結(jié)果率與單果結(jié)籽數(shù)量分別可達(dá)86.0%與49.0粒，與人工異交授粉無顯著差異[4]。從傳粉媒介角度分析，可能是鳳丹具有泛化傳粉關(guān)系的訪花昆蟲進(jìn)行高效授粉的結(jié)果。從有性生殖角度看，開花植物的生物學(xué)特性適應(yīng)于其傳粉機(jī)制：有效的傳粉是以高效的授粉媒介、大量的花粉和合適的接受柱頭為基礎(chǔ)[5]?；ǚ垌氃诰哂谢盍r到達(dá)處于可授期的柱頭方能完成授粉過程?；ǚ鄞婊钇诘拈L短與柱頭適宜授粉時間的長短結(jié)合在一起，極大地影響著植物的自交授粉率、授粉成功率等[1,6-7]，特別是異交傳粉的植物。生殖同步性被普遍認(rèn)為是促進(jìn)植物繁殖成功的主要因子[8-9]。因此，花粉活力保持時間、柱頭可授期以及花期相遇(包括開花同步性)等成為促進(jìn)鳳丹繁殖成功所必須關(guān)注的問題。

鳳丹為楊山牡丹栽培種，屬芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬多年生落葉小灌木，廣泛種植于我國亞熱帶與溫帶地區(qū)[10-11]。鳳丹繁育系統(tǒng)主要為異交繁殖，自交結(jié)果率與單果結(jié)籽數(shù)量及種子質(zhì)量均非常低[4]。作為一種優(yōu)質(zhì)食用油原料植物，鳳丹種子油富含不飽和脂肪酸，其中具“血液營養(yǎng)素”之稱的α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)含量高達(dá)42%，遠(yuǎn)高于其他食用油[12]。目前，關(guān)于鳳丹的研究大多集中于栽培管理、自毒物質(zhì)檢測、遺傳多樣性以及灰霉病流行特征等方面[10-13]，而對其繁殖特性的研究非常少見。鑒于此，在對鳳丹花粉活力與壽命及其柱頭可授期進(jìn)行室內(nèi)化學(xué)檢測以及田間套袋觀測的基礎(chǔ)上，結(jié)合其群體花朵開放式樣的調(diào)查結(jié)果，分析其有性生殖成功的成因，為鳳丹有性繁殖機(jī)制的揭示及其高效栽培管理、常規(guī)雜交育種等提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗于2017—2018年進(jìn)行。試驗地點位于重慶市墊江縣長龍鎮(zhèn)(107.406 42°E、30.305 57°N，海拔385 m)。墊江縣位于重慶市東北部，地貌以低丘為主，年均溫17 ℃，年均降水量1 160 mm，年均日照時數(shù)1 260 h，為中亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候。鳳丹群體花期為3月上旬至下旬，盛花期為3月中旬，果期為同年7—8月。鳳丹栽培為當(dāng)?shù)卮迕裰饕?jīng)濟(jì)來源之一，常年種植面積達(dá)1 000 hm2。

1.2 鳳丹花部特征調(diào)查

選擇標(biāo)記10株鳳丹標(biāo)準(zhǔn)植株及花朵，觀察花朵顏色、形狀、氣味、有無花蜜等。選取即將開放的單花，每天觀測其單花開放進(jìn)程，包括花瓣展開、雄蕊位置變化、花藥開裂、花粉釋放、柱頭表面有無分泌液等。隨機(jī)選取30朵花，觀測花部形態(tài)，并測量花冠直徑、雄蕊數(shù)目、心皮數(shù)目以及胚珠數(shù)目等花部特征。

1.3 鳳丹花粉活力檢測

選擇生長一致、即將開放的鳳丹花朵，套袋標(biāo)記10朵(1朵/株)，分別于開花后第1、2、3、4天收集供試花粉?；ǚ刍盍z測采用TTC染色法進(jìn)行：將供試花粉置于載玻片中央，并以高溫加熱致死的花粉作參照[14]，將1～2滴0.5% TTC溶液滴于供試花粉中，混合均勻后覆上蓋玻片，置于內(nèi)有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，于37 ℃條件下放置20 min,在Olympus顯微鏡下進(jìn)行觀察記錄?；ǚ蹫榧t色表示有活力，若為黑色或無顏色變化或淺紅色則表示無活力。每一制片觀察5個視野，統(tǒng)計花粉總數(shù)與有活力的花粉數(shù)目，計算有活力花粉所占比例。重復(fù)10次。

1.4 鳳丹柱頭可授性檢測

用聯(lián)苯胺-H2O2氣泡染色法即過氧化物酶染色法檢測鳳丹柱頭可授性[14]，柱頭表面的過氧化酶活性與柱頭可授性呈正相關(guān)。分別采集花后不同天數(shù)的柱頭備用。將柱頭置于凹形載玻片上，將聯(lián)苯胺-H2O2溶液(V1%聯(lián)苯胺∶V3% H2O2∶V水=4∶11∶22)置于供試柱頭。在Olympus解剖鏡下觀察，柱頭染色越深、周圍氣泡越多表明柱頭可授性越強(qiáng)，反之則越弱，無氣泡產(chǎn)生且不變藍(lán)表明柱頭無可授性。

1.5 鳳丹花粉活力和柱頭可授性的套袋檢測

采用去雄、硫酸紙?zhí)状叭斯ぎ惢ㄊ诜鄯椒y定花粉活力與柱頭可授期?；ǚ刍盍Φ奶状鼨z測：標(biāo)記1朵即將開放的花朵，于開花后第1、2、3、4天采集花粉，同時每天分別標(biāo)記30朵即將開放的異株花朵，取花后不同天數(shù)的花粉為柱頭授粉。柱頭可授性的套袋檢測：每個處理隨機(jī)標(biāo)記30朵花朵，在單花開花后第1、3、5、7天分別取異株花朵花后第1天的花粉對柱頭進(jìn)行人工授粉。以上處理均在授粉后60～70 d記錄結(jié)果與結(jié)籽情況。所有處理均重復(fù)3次。由于大部分花朵均能結(jié)果并產(chǎn)生不同數(shù)目的種子(個別花朵因感染灰霉病停止發(fā)育)，因此檢測結(jié)果以單果平均種子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

試驗所用套袋花朵均在花朵尚未開放、柱頭表面無花粉、花藥未開裂時進(jìn)行去雄處理。人工異花授粉時間參照同一群落中其他未套袋花朵的自然授粉時間。同樣，參照同一群落其他未套袋花朵，在柱頭干枯、心皮明顯增大、花瓣已經(jīng)枯萎凋落時去掉套袋。在套袋期間，經(jīng)常對供試花朵進(jìn)行觀察，同時揭袋通風(fēng)換氣，避免花器霉變。

1.6 鳳丹花開放式樣調(diào)查

開放式樣指花朵開放數(shù)量在群體水平上表現(xiàn)出的時空動態(tài)。在試驗點分別選取位于南坡(樣地1)、東坡(樣地2)、西坡(樣地3)的3塊樣地，在每塊樣地內(nèi)選擇長勢較好、花朵尚未開放的植株約300株進(jìn)行標(biāo)記。觀察記錄植株上的花朵數(shù)量和群體開放動態(tài)，即從第1朵花開放開始，每天記錄1次開花情況，直至所有花朵全部開放。最后統(tǒng)計每天開放的花朵數(shù)量占花朵總數(shù)百分比，以開放花朵數(shù)占花蕾總數(shù)的5%為始花期，凋謝花朵數(shù)大于花蕾總數(shù)的95%為末花期。

群體的開花同步性檢測采用開花同步性指數(shù)Xi進(jìn)行[9]，計算公式如下：

式中，n為開花群體中調(diào)查個體的總數(shù)，fi為個體i開花的總天數(shù)，ej表示個體i和j花期重疊天數(shù)(j≠i)。Xi值的變化區(qū)間為0～1，當(dāng)Xi=0時表明個體花期完全沒有重疊，當(dāng)0

1.7 數(shù)據(jù)分析

花部形態(tài)特征、花粉活力等的觀測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。采用 SPSS 22.0軟件對鳳丹開花后不同天數(shù)的花粉活力差異，以及花粉活力與柱頭可授性變化的套袋檢測結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹花部形態(tài)特征

鳳丹花冠碩大，直徑達(dá)(15.3±0.2)cm，開放時呈淺盤狀。單花頂生，兩性，無花蜜，有輕微氣味?；ü诎咨?偶淡粉色)，花藥黃色，花絲淡紫色，柱頭紫紅色。雄蕊多數(shù)，雄蕊群直徑(3.5±0.1)cm?；ㄋ幎?，長圓形，開裂時能釋放出大量肉眼可見的亮黃色花粉?；ǚ哿Ｍ獗诠饣?，不具黏性，輕搖花朵可見大量花粉掉落花盤基部。柱頭常5枚(偶6～8枚)，呈“C”形，并于上端與花柱合生。柱頭表面密被刷狀柱頭毛，能分泌黏液。子房上位，心皮5(偶6～8)，單心皮具(13.3±0.3)枚胚珠，子房具(67.0±2.8)枚胚珠。

2.2 鳳丹花粉活力

鳳丹單花期4～7 d。第1天，當(dāng)蓇葖露出約2～3 cm時，花瓣逐漸裂開至展平，花藥由黃白變黃，花絲由緊貼子房變?yōu)橹饾u伸長并分散、遠(yuǎn)離柱頭(圖1A)?；ㄋ巸蓚?cè)藥室同時由頂端向下縱裂散粉，開裂長度為藥室長度的2/3(圖1A)。第2天，藥室繼續(xù)往下開裂，至中午即完全開裂(圖1B)。第3天，藥室上部失水干癟，顏色由黃色變?yōu)辄S褐(圖1C)。第4天，整枚花藥變得干癟，顏色從黃紅變黃褐。藥室壁花粉殘留在藥室壁或散落在花盤基部?；ńz逐漸失水干枯，上部顏色由紫色變紫白。傍晚開始部分脫落(圖1D)。花瓣仍可保持?jǐn)?shù)天新鮮。在連續(xù)陰天里，花藥不能開裂釋放花粉，或者出現(xiàn)花藥發(fā)育不良(如雄蕊瓣化或僅有花絲沒有花藥)。

鳳丹花粉壽命為4 d。第1天上午9：30左右，花藥開始開裂散粉。花粉活力在4 d之間差異顯著(F=33.39,df=3,P<0.05，表1)。第1天花粉活力最高，為(65.2±2.6)%；第2天花粉活力為(57.4±2.5)%，與開花第1天花粉活力無顯著差異(P=0.42)。第3天，花粉活力降低到(43.9±1.8)%，與開花第2天花粉活力存在顯著差異(P<0.05)。第4天，花粉活力降為(19.5±2.2)%，與開花第3天花粉活力存在顯著差異(P<0.05)。

A.第1天開始釋放花粉; B.第2天花粉完全釋放; C.第3天藥室上部變枯; D.第4天雄蕊干枯部分脫落； 標(biāo)尺=2 cm A.Stamen began to release pollen at the 1st day; B.Stamen released all pollen grains at the 2nd day; C.Upper part of anther locules began to dry at the 3rd day; D.Stamen began to dry and fall off at the 4th day; Scale bars=2 cm圖1 鳳丹單花開放過程 Fig.1 Flowering dynamic of Paeonia ostii

表1 鳳丹開花過程中花粉活力與柱頭可授性的日變化Tab.1 Daily changes in pollen viability and stigma receptivity of Paeonia ostii during flowering process

注:*表示雄蕊部分脫落,++++表示柱頭可授性最強(qiáng); +++/-表示柱頭可授性較強(qiáng); ++/--表示柱頭可授性中等; +/---表示柱頭可授性較弱; ----表示柱頭失去可授性；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:*means some anthers falling off,++++means stigmatic receptivity(SR) is the highest; +++/- means SR is high; ++/--means SR is moderate;+/--- means SR is low; ----means SR is lost;Different letters in the same column mean the significant difference(P<0.05).

2.3 鳳丹柱頭可授性

由表1可見，鳳丹柱頭壽命4～7 d。第1天，柱頭逐漸展開，柱頭表面最初較硬，且無昆蟲訪花。下午逐漸變軟，有昆蟲訪花，傍晚即可黏附較多花粉。第2天，未授粉柱頭表面開始分泌黏液。第3天，未授粉柱頭可見黏液流到柱頭底端。第4天，未授粉柱頭表面開始部分變干變硬，柱頭底端黏液凝結(jié)成透明膠體。柱頭顏色在開花后第1～4天為紫色，第5～8天由亮紫色變?yōu)榘底仙?。開花后第8天，仍未授粉的柱頭表面完全變干變硬。柱頭宿存心皮至果熟。

由表1可見，鳳丹柱頭可授期為4～7 d。第1天柱頭表面具有較強(qiáng)過氧化物酶活性，可授性較強(qiáng)；第2～3天柱頭具有強(qiáng)過氧化物酶活性，可授性最強(qiáng)。第4天后，柱頭過氧化物酶活性降低，可授性逐漸降低。隨著開花天數(shù)增加，柱頭可授性繼續(xù)降低。到第8天，幾乎所有柱頭表面變干，表明柱頭表面不再有過氧化物酶活性而失去可授性。在連續(xù)陰天里，柱頭表面比較硬，可授性非常低?？梢?，鳳丹花粉活力與柱頭可授期重疊，且由于柱頭可授期相對較長，有利于提高授粉概率。

2.4 鳳丹花粉活力和柱頭可授性的套袋檢測結(jié)果

利用去雄、人工異交授粉與套袋檢測方法發(fā)現(xiàn)，開花后第1、2、3、4天的花粉均具有活力，開花后第1、3、5、7天的柱頭均具有可授性(圖2)?？梢?， 套袋結(jié)果與TTC方法測定的花粉活力以及用聯(lián)苯胺-H2O2法檢測的柱頭可授性結(jié)果總體一致，即花粉活力或柱頭可授性較低的時候，其結(jié)籽量也較低，反之亦然。采用花后第1、2、3、4天的花粉對鳳丹柱頭進(jìn)行授粉后， 結(jié)籽量差異顯著(F=8.50，df=3，P<0.05，圖2)。其中，花后第1天與第2天的花粉授粉后的單果結(jié)籽量最高，二者之間差異不顯著(P>0.05)；花后第3天的花粉授粉后仍具有較高的結(jié)籽量，與花后第2天的花粉授粉后的結(jié)籽量差異不顯著(P>0.05)；花后第4天的花粉授粉后結(jié)籽量顯著低于第3天(P<0.05)。總體看來，由于套袋檢測均為人工異花授粉，柱頭能夠接受到充足異交花粉，因此，在花粉活力不高時仍有相對較高的結(jié)籽量。

A.不同日齡花粉授粉后的單果結(jié)籽數(shù)； B.不同日齡柱頭授粉后的單果結(jié)籽數(shù)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) A.Seeds per follicle after different days of pollen grains pollinated to the 1st day stigma; B.Seeds per follicle after different days of stigma being pollinated with the 1st day pollen grains; Different letters mean the significant difference(P<0.05) 圖2 鳳丹花粉活力與柱頭可授性的結(jié)實檢測 Fig.2 Seeding test of pollen viability and stigma receptivity of P.ostii

柱頭可授性對植物的繁殖成功也起著重要作用。鳳丹花后第1、3、5、7天的柱頭在接受異花花粉后，其結(jié)籽數(shù)差異顯著(F=23.39，df=3，P<0.05，圖2)。其中，以花后第1、3天柱頭具有較高可授性?；ê蟮?天柱頭授粉的結(jié)籽數(shù)與第1天較為相近(P=0.48)，表明第3天的柱頭可授性較高，因此單果結(jié)籽數(shù)主要受花粉活力影響。柱頭花后第5天授粉后的結(jié)籽數(shù)與第3天結(jié)籽數(shù)差異顯著(P<0.05)，第5～7天，柱頭可授性下降很快，鳳丹果實產(chǎn)生少量種子，甚至無法結(jié)籽，單果結(jié)籽數(shù)差異顯著(P<0.05)。

2.5 鳳丹花朵開放式樣

鳳丹群體花期為3月中旬至4月初，鳳丹植株所在樣地不同，群體花朵的開放持續(xù)時間也有差異(圖3)。群體開花平均持續(xù)時間為17.7 d(15～19 d)，其中始花期持續(xù)6.7 d(6～8 d)，開花比例不到5%，隨著開花比例增加逐漸進(jìn)入盛花期，持續(xù)時間為7.7 d(7～8 d)，最后進(jìn)入末花期，持續(xù)時間3.3 d(1～5 d)。從開花動態(tài)看，開花比例在前期較低，隨著時間推移緩慢上升至高峰期，隨后快速下降，開花曲線整體呈單峰模式。開花同步性觀測結(jié)果表明，樣地不同，花期重疊期也有所差異，花期同步指數(shù)分別為0.78、0.83、0.85，平均為0.82。因此，鳳丹群體開花同步性顯著，呈“集中開花模式”。

圖3 鳳丹花不同樣地群體開花特性Fig.3 Flowering features of Paeonia ostii population in different sample plots

3 結(jié)論與討論

植物花粉存活時間的長短，一方面由遺傳因素所決定，另一方面也受環(huán)境因子的影響[9,15]。如刺五加(Acanthopanaxsenticosus)長花絲植株的花粉活力高于中花絲植株，花粉活力及其降低快慢隨環(huán)境變化而有所不同[16]；海棗(Phoenixdactylifera)的花粉可存活數(shù)月至1 a；茄(Solanummelongena)的花粉在冬季可以存活3 d，在夏季僅能保持1 d[17]。對鳳丹花朵而言，其花粉可存活4 d，花粉活力第1、2天最高，第3天顯著降低，至第4天花藥藥室與花絲逐漸枯萎，僅有少量花粉存活。根據(jù)這一特征，可以采集鳳丹開花后第1、2天的花粉貯存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行人工授粉，為其異地引種或雜交育種提供技術(shù)保證。鳳丹花粉不具黏附性，由于昆蟲訪花頻繁而大量掉落于花盤，且鳳丹花期臨近清明，由于雨水的沖刷，花粉較易折損。鳳丹的花粉胚珠比(P/O比)高達(dá)58 940，極高的P/O比可以補(bǔ)償由于降雨沖刷及蜂類收集花粉而引起的花粉損失。

柱頭可授性為植物兩性繁殖中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，其可授期保持時間的長短直接影響花朵的授粉結(jié)實[3,14]。不同植物的柱頭可授期也有所差異，持續(xù)時間從數(shù)小時到幾十天不等，并受開花后天數(shù)、單花期長短、同一天不同時段以及柱頭表面有無分泌物等因素的影響。如大花蕙蘭(Cymbidiumhybridum)的柱頭在整個花期中均具有一定的可授性，以開花后20～40 d 的可授性最強(qiáng)，45 d 以后柱頭可授性逐漸減弱[18]；多枝檉柳(Tamarixramosissima)柱頭在花朵未完全開放時就已有可授性，完全開放至花后4 h可授性達(dá)到最強(qiáng)[19]。此外，柱頭可授性與花部形態(tài)特征之間也有對應(yīng)關(guān)系[2]。鳳丹為兩性花，無蜜腺，提供給訪花昆蟲的唯一酬物為大量花粉。因此，一旦花朵的雄蕊開始枯萎，訪花昆蟲數(shù)目很快減少。由于鳳丹花朵呈現(xiàn)集中開放，花期后期開放花朵較少，有少量訪花昆蟲，蜂類與甲蟲也會訪問花絲枯萎、藥室由黃色變?yōu)辄S褐色的花朵，同時也增加了柱頭的授粉概率。

近年來,植物花朵開放式樣與授粉媒介及花粉流之間的相互影響引起一些科研人員的關(guān)注[3,20]。HARDER等[21]通過人為控制水浮蓮(Eichhorniacrassipes)兩性花的開放數(shù)目，發(fā)現(xiàn)多花的開放式樣顯著增加了傳粉媒介的訪問。鳳丹為兩性花植物，繁育系統(tǒng)為異交繁育系統(tǒng)，自交結(jié)籽率極低，只有通過昆蟲才能完成異花傳粉過程。鳳丹花的雄蕊壽命僅4 d，花粉活力較低，從開花到凋謝，昆蟲僅有4 d的訪花時間。倘若有不良環(huán)境因子出現(xiàn)(如雨水、陰天等)，昆蟲無法及時訪花，無疑會影響鳳丹的傳粉與結(jié)實，這顯然不利于鳳丹的繁殖成功。然而，鳳丹開花特性及繁殖對策具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。首先，鳳丹花冠碩大，雄蕊數(shù)量多且呈亮黃色，對昆蟲的招引作用明顯。其次，鳳丹具有較大開放式樣。鳳丹單花頂生，群體花朵的開花同步性高，呈集中開花模式，亦為適應(yīng)多變環(huán)境條件提供了一定的繁殖保障[9,22-23]。鳳丹花瓣在雄蕊枯萎后仍可保持?jǐn)?shù)日新鮮，使花展示更為醒目。因此，鳳丹花的開放式樣與視覺吸引共同作用增加了對訪花者的吸引力，提高了對花朵的訪花頻率，進(jìn)一步促進(jìn)植物的花粉散布與繁殖成功。

總體而言，花粉活力與柱頭可授性是植物有性繁殖過程的重要組成部分，并進(jìn)一步影響授粉成功率。鳳丹花粉活力保持4 d，柱頭可授性可保持4～7 d，群體具有集中開花模式，相對較長的花粉壽命與柱頭可授期以及較大的開放式樣為其大量產(chǎn)生種子提供了前提條件。此外，鳳丹在雌雄功能上表現(xiàn)為花粉先成熟，花粉存活時間與柱頭可授期表達(dá)時間大部分重疊，為其自花授粉提高了概率。盡管鳳丹繁育系統(tǒng)為自交親和力低的異交繁育系統(tǒng)，但大量自花花粉滯留柱頭必然會導(dǎo)致柱頭堵塞，影響異源花粉的擴(kuò)散與萌發(fā)。因此，鳳丹是否存在其他機(jī)制避免自花花粉在柱頭上散布，還需進(jìn)一步研究。