藏藥菥蓂子的定性、定量方法研究Δ

宋文靜，張煒，駱桂法#，海平，郭全興（1.青海省心腦血管病專科醫(yī)院藥劑科，西寧81001；.青海省藥品檢驗檢測院藏藥室，西寧 810003）

菥蓂子系常用藏藥材，藏文名“寨卡”，為十字花科植物菥蓂的干燥成熟種子，一年生草本植物，藏醫(yī)常用于清肺熱、腎熱及健胃，主治肺熱、咳嗽、腎熱[1]。在公元8～9世紀創(chuàng)作的藏醫(yī)藥名著《月王藥診》[2]和《醫(yī)學四續(xù)》[3]中均有菥蓂子配方使用的記錄。清代藏醫(yī)藥著作《晶珠本草》[4]、《藍琉璃》[5]等稱菥蓂（子）為“折嘎哇”，記錄其：生長在松軟的土地及田間；葉濃綠而厚，莖似竹而枝多，有光澤，花小，白色，果實似小手鼓，種子小，紅紫色，表面有明顯的斑點和花紋；味辛，性潤，有蒜味；清肺熱、腎熱，治肺病、腎?。婚_胃，燥四肢黃水（即四肢關節(jié)腫脹、疼痛等[6]），治培根木布病、黃水病[7]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中描述其味辛、微溫，主明目、目痛淚出，除痹，補五臟，益精光[8]。

菥蓂廣布于全國各省區(qū)，生于海拔4 000 m以下的山地路旁、溝邊、田畔及山谷草地中，在亞洲、歐洲、非洲北部均有分布。從植物分類學角度看，還存在西藏菥蓂、新疆菥蓂、四川菥蓂、山菥蓂、云南菥蓂等同屬近緣品種，但由于菥蓂分布較廣，資源豐富，基原植物目前僅收載了菥蓂這一個種[9]。

菥蓂子現(xiàn)收錄于1995年版《衛(wèi)生部藥品標準》1995年版藏藥第一冊[1]，雖然作為數(shù)個成方制劑的組方藥材，但其質量標準較不完善，標準中僅有基原、性狀、理化鑒別項，缺乏質控指標，質量控制水平不佳。菥蓂子現(xiàn)已廣泛用于臨床，藏醫(yī)常用組方有十三味菥蓂丸（膠囊）、二十八味檳榔丸和十九味草果散等。根據(jù)原國家藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)系統(tǒng)查詢得知，十三味菥蓂丸（膠囊）、二十八味檳榔丸已批準上市生產(chǎn)，生產(chǎn)企業(yè)分別為14、3家。另據(jù)筆者的調(diào)查，十九味草果散在青海省海西州蒙藏醫(yī)院、玉樹州稱多縣藏醫(yī)院等醫(yī)療機構中作為醫(yī)院制劑使用。目前對該藥材質量控制方法的研究少見報道，菥蓂子主要含有黃酮類化合物、硫代葡萄糖苷（如黑芥子苷）、芥子酶、揮發(fā)油、吲哚、有機酸、糖、微量元素等多類活性物質[10-11]。其中異牡荊苷、當藥黃素為菥蓂子中目前已知的主要黃酮類化合物，另有葒草苷、木犀草素、新橙皮苷、芹菜素、香葉木素等，大部分具有較強的抗氧化活性，具有廣譜抑菌消炎和抗毒素的作用[12]；黑芥子苷等硫代葡萄糖苷類成分具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗腫瘤、抗氧化的生物活性[13]。各活性成分的作用與菥蓂子具有抗氧化、抗毒素、抗菌、抗癌等作用的報道[14]相符。

在菥蓂子的質量控制方面，目前主要有陳玉等[15-16]建立了高效液相色譜法測定其中黑芥子苷的含量的方法，錢宇等[17-18]采用二硝基水楊酸（DNS）比色法測定了菥蓂子中還原糖、蔗糖及多糖的含量。在以上報道中，質控指標較單一，不能全面控制藥材質量。故在本試驗中，筆者采用薄層色譜法和高效液相色譜法對藥材中的黃酮類成分[19]異牡荊素、當藥黃素及硫代葡萄糖苷類成分[20]黑芥子苷建立定性和定量質控方法，以期為更科學、更全面地控制該藥材質量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Linomat 5半自動薄層點樣儀、TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)、winCATS色譜工作站（瑞士卡瑪公司）；LC 20T高效液相色譜儀，包括SPD-M 20A光電二極管陣列檢測器、LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；e 2695高效液相色譜儀，包括2998光電二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國沃特世公司）；BSA 224 S-CW型電子天平、XS 105DU型電子天平（德國賽多利斯公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國默克密理博公司）；Q250DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；DK-S16恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江臺州四甲生化塑料廠，批號：20170122，規(guī)格：10 cm×20 cm）；HPTLC Silica gel 60型硅膠GF254高效薄層色譜板（德國默克公司，規(guī)格：10 cm×20 cm）。

1.2 藥品與試劑

15批菥蓂子藥材，8批于2017年5－8月采集于青海省海北州門源縣、海東市互助縣等地區(qū)，7批為市售購買樣品，所有樣品均經(jīng)青海省藥品檢驗檢測院駱桂法主任藥師鑒定為十字花科菥蓂屬植物菥蓂的干燥成熟種子，即為菥蓂子；黑芥子苷對照品（北京世紀奧科生物技術有限公司，批號：130201，純度：≥98%）；異牡荊素對照品（批號：2246，純度：≥99%）、當藥黃素對照品（批號：4039，純度：≥99%）均購自上海詩丹德生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司）；乙酸乙酯、冰醋酸等其余試劑均為分析純（西隴科學股份有限公司）；水為超純水。藥材來源信息詳見表1。

表1 菥蓂子藥材樣品來源Tab 1 Sample source of T.semen

2 方法與結果

2.1 樣品中異牡荊素、當藥黃素的薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取菥蓂子藥材30 g，粉碎，過50目篩；精密稱取藥材粉末2.0 g，置于錐形瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，置于90℃水浴中加熱回流1 h，過濾；濾液濃縮至無醇味（約剩8～10 mL），再加水10 mL，攪勻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，棄去水液，合并乙酸乙酯液，減壓濃縮得到浸膏。然后取浸膏加甲醇2 mL使溶解，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取當藥黃素、異牡荊素對照品5.08、5.12 mg，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得。

2.1.3 色譜條件 薄層板：聚酰胺薄膜；展開劑：三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（11∶1∶1，V/V/V）；顯色劑：20 g/L的三氯化鋁乙醇溶液；點樣量：對照品溶液2 μL，供試品溶液 4 μL。

2.1.4 鑒別結果 按照“2.1.1”項下方法分別制備15批次菥蓂子藥材供試品溶液。分別吸取供試品溶液及“2.1.2”項下異牡荊素、當藥黃素對照品溶液，注入半自動薄層點樣儀，按照“2.1.3”項下色譜條件點樣、展開，晾干，噴以質量濃度為20 g/L的三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置于366 nm波長紫外光燈下檢視并拍照。結果，在15批次菥蓂子供試品薄層色譜中，在與當藥黃素、異牡荊素對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，其平均比移值分別為0.18、0.72（n＝15），色譜圖見圖1。

2.2 樣品中黑芥子苷薄層色譜鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取菥蓂子藥材30 g，粉碎，過50目篩；精密稱取藥材粉末1.5 g，置于錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，靜置至室溫，濾過，濾液減壓干燥至近干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黑芥子苷對照品20.38 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得。

2.2.3 色譜條件 薄層板：高效硅膠GF254薄層板；展開劑：乙酸乙酯-甲醇-三乙胺（4∶5∶0.5，V/V/V）；點樣量：對照品溶液10 μL，供試品溶液10 μL。

2.2.4 鑒別結果 按照“2.2.1”項下方法分別制備15批次菥蓂子藥材供試品溶液。分別吸取供試品溶液及“2.2.2”項下黑芥子苷對照品溶液，注入半自動薄層點樣儀，按照“2.2.3”項下色譜條件點樣、展開，晾干，置于254 nm紫外光燈下檢視并拍照。結果，在15批次菥蓂子供試品薄層色譜中，在與黑芥子苷對照品色譜相應的位置上，顯相同的黑色熒光猝滅斑點，其平均比移值分別為0.42（n＝15），色譜圖見圖2。

圖2 黑芥子苷薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of sinigrin

2.3 含量測定

2.3.1 異牡荊素、當藥黃素色譜條件 色譜柱：CAP-CELL PAK MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：336 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。流動相梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program of mobile phase

2.3.2 黑芥子苷色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.02 mol/L四丁基硫酸氫銨水溶液（三乙胺調(diào)pH至6，15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：227 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.3 溶液的制備 （1）對照品溶液。精密稱取異牡荊素、當藥黃素對照品15.82、15.08 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成異牡荊素、當藥黃素質量濃度分別為0.632、0.603 mg/mL的混合溶液，作為1號對照品貯備溶液；精密吸取上述溶液加入甲醇稀釋40倍，制成質量濃度分別為15.8、15.1 μg/mL的混合溶液，作為1號對照品溶液。

精密稱取黑芥子苷對照品16.02 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水溶解并定容至刻度，制成黑芥子苷質量濃度為0.640 mg/mL的溶液，作為2號對照品貯備溶液；精密吸取上述溶液加水稀釋5倍，制成質量濃度為128.0 μg/mL的溶液，作為2號對照品溶液。

（2）供試品溶液。參照文獻方法[15，21]。稱取菥蓂子藥材30 g，粉碎，過50目篩；精密稱取藥材粉末約1.5 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇溶液，稱定質量；置于90℃水浴中加熱回流2 h，靜置至室溫，再稱定質量，用60%的乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過；濾液濃縮至無醇味（約剩8～10 mL），加水10 mL，攪勻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL；棄去水液，合并乙酸乙酯液，減壓干燥至近干；殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至5 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得1號供試品溶液。

再精密稱取藥材粉末約0.5 g，置于錐形瓶中，精密加入40%乙醇溶液50 mL，稱定質量，置于90℃水浴中加熱回流45 min，靜置至室溫；再稱定質量，用40%乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得2號供試品溶液。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取“2.3.3”項下1號、2號對照品溶液及1號、2號供試品溶液各10 μL，分別按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷在各相應檢測條件下均與其他成分完全分離，各成分色譜峰之間及與相鄰色譜峰之間分離度均＞1.5，其他成分對待測成分的測定未見干擾。理論板數(shù)以異牡荊素峰計不低于6 000，以黑芥子苷峰計不低于3 000，各溶液的色譜圖見圖3。

2.3.5 線性關系考察 精密吸取“2.3.3”項下1號對照品貯備溶液0.2、0.5、1.2、2.5、5.0、12.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻；精密吸取“2.3.3”項下2號對照品貯備溶液0.2、0.4、1.0、3.0、6.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，制成異牡荊素、當藥黃素和黑芥子苷的系列質量濃度溶液。分別按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得到3種成分的線性關系結果。結果表明，3種成分在各檢測質量濃度范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好的線性關系，詳見表3。

表3 3種成分的線性關系及檢測限、定量限Tab 3 Linear ranges，LODs and LOQs of 3 components

2.3.6 檢測限與定量限考察 分別量取“2.3.3”項下1、2號對照品溶液適量，倍比稀釋，分別按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為3∶1時，得檢測限；當信噪比為10∶1時，得定量限，結果詳見表3。

2.3.7 精密度試驗 分別取“2.3.3”項下1、2號對照品溶液適量，分別按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷峰面積的RSD分別為0.3%、0.4%、0.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取S8號菥蓂子藥材，按“2.3.3（2）”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷峰面積的RSD分別為0.4%、1.1%、0.2%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復性試驗 取S8號菥蓂子藥材，按“2.3.3”項下方法分別制備供試品溶液，平行6份，按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷平均含量的RSD分別為0.4%、0.7%、1.9%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 稱取已知含量的S8號菥蓂子藥材（異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷含量分別為0.064、0.024、30.15 mg/g）粉末約0.75、0.25 g，各6份，粉碎，過50目篩，分別加入約與樣品中3種成分含量相同的對照品，按“2.3.3（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷的平均加樣回收率分別為99.1%、97.0%、98.1%，RSD分別為1.9%、1.8%、1.8%（n＝6），詳見表4。

2.3.11 樣品含量測定 稱取編號S1～S15的菥蓂子藥材，按“2.3.3（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”和“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，15批菥蓂子藥材中異牡荊素、當藥黃素、黑芥子苷含量范圍分別為0.013～0.090、0.020～0.130、18.92～40.75 mg/g，詳見表5。

表4 回收率試驗結果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

表5 15批菥蓂子中3種成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of content determination of 3 components in 15 batches of T.semen（n＝3，mg/g）

3 討論

薄層色譜法能夠快速、靈敏、高效地同時分離多種樣品，且固定相和展開劑的選擇范圍較大，具有操作方便、設備簡單、分離效率高、專屬性好、分析速度快等特點，能同時分離多種樣品且斑點明晰鮮艷、直觀，便于鑒別，彌補了因含有無紫外吸收、無揮發(fā)性等成分無法采用高效液相色譜法和氣相色譜法進行鑒別分析的困境，近年來在中藥與民族藥研究領域得到了廣泛的應用[22]。高效液相色譜法在藥材的定性定量分析、質量控制方面使用也十分廣泛，采用該法對藥材進行多組分含量測定更有利于控制該藥材的整體質量[23]。因此，本文采取以上2種成熟、簡便的方法建立了菥蓂子的質量控制方法。

針對菥蓂子中所含的黃酮類、硫代葡萄糖苷類成分，在前期研究中筆者開展了固定相和展開劑的交叉篩選試驗。在異牡荊素、當藥黃素的鑒別試驗中，固定相分別使用了硅膠G薄層板、高效硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜等進行試驗，展開劑嘗試分別以36%乙酸、正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5，V/V/V）、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（16∶1∶1，V/V/V）、（11∶1∶1，V/V/V）、（8∶1∶1，V/V/V）為展開劑進行試驗；結果以聚酰胺薄膜為固定相，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（11∶1∶1，V/V/V）為展開劑時分離效果最佳。在黑芥子苷的鑒別試驗中，固定相分別使用了硅膠G薄層板、高效硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜等進行試驗，嘗試分別以乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶10∶1，V/V/V）、乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（3.5∶5∶1∶0.5，V/V/V/V）、乙酸乙酯-甲醇-三乙胺（4∶5∶0.5，V/V/V）為展開劑進行試驗，結果以高效硅膠GF254為固定相，以乙酸乙酯-甲醇-三乙胺（4∶5∶0.5，V/V/V）為展開劑時分離效果最佳。最終試驗結果表明，在以上條件下目標物分離度較好、斑點清晰、重復性良好，可作為菥蓂子藥材的定性鑒別依據(jù)。

本文選用異牡荊素、當藥黃素和黑芥子苷3種成分作為菥蓂子藥材的含量測定指標成分，已有臨床研究表明這3種成分具有抗菌消炎、鎮(zhèn)咳平喘、抗腫瘤、抗抑郁[24-26]的作用，這與菥蓂子治療腎炎、肺炎、止咳等功效相吻合。但由于黑芥子苷的電離能力較強，樣品在色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，無法做到3種成分同時測定，因此最終選用了離子對試劑四丁基硫酸氫銨與乙腈作為流動相測定黑芥子苷，0.4%冰醋酸溶液與乙腈為流動相測定異牡荊素和當藥黃素，分別建立了2個含量測定方法。根據(jù)15批次菥蓂子藥材的測定結果，上述方法具有較好的精密度和準確度，方法學考察結果良好，可以為藏藥材菥蓂子的質量評價及標準制訂提供參考。